Eine kurze Diskussion über die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Technologie

Eine kurze Diskussion über die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Technologie

Gegenwärtig wird die quantitative PCR-Technologie nach den verschiedenen fluoreszierenden Chemikalien, die in der quantitativen Echtzeit-PCR verwendet werden, hauptsächlich in zwei Kategorien unterteilt, nämlich in Fluoreszenzfarbstoffe und Fluoreszenzsonden. Fluoreszenzfarbstoffe sind eine unspezifische Nachweismethode für amplifizierte Sequenzen und sind die frühesten Methoden, die in der quantitativen Fluoreszenz-PCR verwendet werden. Fluoreszenzsonden sind eine quantitative PCR-Technologie, die auf dem Prinzip des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) beruht.

Fluoreszierender Farbstoff

Die Fluoreszenzfarbstoffmethode ist auch als DNA-Bindungsfärbung bekannt. DNA-bindende Farbstoffe sind die ersten Chemikalien, die in der quantitativen Fluoreszenz-PCR verwendet werden. Das derzeit hauptsächlich verwendete Farbstoffmolekül ist SYBR Green I. SYBR Green I kann spezifisch an die Nebenrille von DNA-Doppelsträngen binden. Freies SYBR Green I hat fast kein Fluoreszenzsignal, aber nach der Bindung an die DNA kann sich sein Fluoreszenzsignal um das Hundertfache erhöhen. Je mehr Produkte durch PCR amplifiziert werden, desto mehr SYBR Green Ⅰ wird gebunden und desto stärker ist das Fluoreszenzsignal [1], wodurch jedes Zielgen quantifiziert werden kann.

▲Das Grundprinzip von SYBR GreenⅠluminosity

Hydrolyse-Sonde

Hydrolyse-Sonden werden durch TaqMan-Sonden repräsentiert, die auch als Exonuklease-Sonden bekannt sind. Die TaqMan-Technologie ist eine Art von quantitativer Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Technologie, die 1996 von der amerikanischen PE-Firma erforscht und entwickelt wurde, und die weithin für den quantitativen Nachweis von Genen verwendet wird [2,3]. Das Grundprinzip besteht darin, die 5'-Exonukleaseaktivität des Taq-Enzyms zu nutzen, d. h. das Taq-Enzym hat eine natürliche 5'-3'-Exonukleaseaktivität, die Nukleotide am 5'-Ende der doppelsträngigen DNA spalten und eine einzelne Oligonukleotidsäure freisetzen kann.

▲Grundprinzip des TaqMan

▲Vergleich der Vor- und Nachteile der Methoden

Technische Grundlagen der SpaceGen-Produkte:

Nach einer Reihe von Transformationen kann unmethyliertes Cytosin (C) in Uracil (U) umgewandelt werden. Nach der PCR-Reaktion wird Uracil (U) schließlich in Thymin (T) umgewandelt, d. h. in unmethyliertes Cytosin (C). Pyrimidin (C) wird schließlich in Thymin (T) umgewandelt; methyliertes Cytosin (C) verändert sich während der Modifikationsreaktion aufgrund der Schutzwirkung seiner Methylgruppe nicht, d. h. methyliertes Cytosin (C) wird in Cytosin (C) umgewandelt.)

Die Methylierungsnachweisprodukte von SpaceGen verwenden die PAP-ARMS®-Technologie, um den fluoreszierenden quantitativen PCR-Nachweis des modifizierten Genoms zu vervollständigen, und kombinieren die Pyrophosphat-Hydrolyse-Aktivierungsreaktion mit dem traditionellen ARMS-Technologieprinzip. Die TaqMan-Sondenmethode und der experimentelle Prozess der Nukleinsäureextraktion - Methylierungsmodifikation - Fluoreszenz-PCR wurden für den Nachweis verwendet.

Referenzen

1、Proc Nat Acad Sci USA，1996，93：14509-14514.

3、Clin Chem Lab Med，1998，36：587-588.

4、Nat Genet，1993，4（3）：289-294.