Was sind Flüssigbiopsieverfahren? by SPACEGENMedicalExpo

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Unter Flüssigbiopsie versteht man die Analyse und Diagnose von Krebs und anderen Krankheiten durch Untersuchung von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten wie Urin, Speichel, Pleuraerguss, Liquor usw. Die Körperflüssigkeit des Patienten wird hauptsächlich als Tumorbiopsieprobe verwendet, und zu den erfassten und nachgewiesenen Objekten gehören zirkulierende Tumorzellen (CTC), zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) und Exosomen in Körperflüssigkeiten. Die Flüssigbiopsie ist einer der heißesten Bereiche der biomedizinischen Industrie der letzten Jahre. Im Vergleich zur herkömmlichen Gewebebiopsie hat die Flüssigbiopsie einige theoretische Vorteile: weniger Trauma, Reproduzierbarkeit, Echtzeitbeurteilung der Wirksamkeit, dynamische Anpassung von Behandlungsentscheidungen usw.

Das Aufkommen der Flüssigbiopsie-Technologie bedeutet für die Menschheit einen weiteren großen Schritt nach vorn auf dem Weg zur Überwindung von Krebs. Im Vergleich zur traditionellen Gewebebiopsie hat die Flüssigbiopsie mehrere Vorteile: Erstens kann die Flüssigbiopsie als Ersatz für Bereiche dienen, die mit der Gewebebiopsie nicht erreicht werden können. Zweitens können Gewebebiopsien nur die Informationen in der Probe wiedergeben, während Flüssigbiopsien den Gesamtzustand des Patienten erfassen können. Darüber hinaus wird bei Flüssigbiopsien in erster Linie zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) nachgewiesen, die typischerweise vom Tumorgewebe in die Blutgefäße gelangt. Daher lassen sich mit Flüssigbiopsien Krebszellen schneller lokalisieren, als wenn man sich bei der Diagnose auf Symptome und Bilder stützt. Die Flüssigbiopsie-Technologie ist kosteneffizient. Durch die nicht-invasive Probenahme kann sie nicht nur die Schwierigkeit der Krebsdiagnose und -behandlung erheblich verringern, sondern auch den Zeitpunkt der Krebsdiagnose vorverlegen und die Überlebenszeit der Patienten effektiv verlängern.

1）Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind definiert als jene Krebszellen, die solide Tumorläsionen verlassen und in den Blutkreislauf gelangen. CTCs sind nicht die einzigen Tumorderivate im Blutkreislauf, aber sie enthalten eine Reihe von metastatischen Vorläufern, die für ein vollständiges Fortschreiten der Krankheit wichtig sind. Zirkulierende Tumorzellen, die in den Blutkreislauf gelangen, enthalten das komplette Genom, Proteom und andere biologische Informationen und haben das Potenzial, sich zu metastasierenden Läsionen zu entwickeln, die die Aggressivität von Tumoren darstellen.

Die technischen Bedingungen schränken jedoch die Isolierung von lebenden CTCs ein, was vor allem darauf zurückzuführen ist, dass CTCs im Vergleich zu Blutzellen sehr selten sind. Dennoch mangelt es nicht an neu entwickelten Technologien, mit denen CTCs sowohl gefangen und isoliert als auch auf molekularer Ebene auf ihre Eignung für klinische Anwendungen getestet werden können. Klinisch haben CTCs ihren Wert als prädiktive Biomarker für die Krankheitsprognose unter Beweis gestellt, und ihre Eignung für andere Anwendungen wird derzeit geprüft. Technisch gesehen ist es in der Regel erforderlich, zirkulierende Tumorzellen aus massiven Blutzellen anzureichern und bösartige Tumorzellen von weißen und roten Blutkörperchen zu unterscheiden.

2) In der Vergangenheit wurden zahlreiche spezialisierte CTC-Isolierungstechniken entwickelt, die sich im Wesentlichen in zwei große Kategorien einteilen lassen: ① Zellen, die CTCs auf der Grundlage einer spezifischen Antigenexpression erfassen (positive Selektion); ② alle Nicht-CTC-Zellen verbrauchen (negative Selektion).

Eine der klassischen zellbasierten (Positivselektion) Techniken für CTCs basiert auf einem zweistufigen Verfahren: Im ersten Schritt wird die Probe zentrifugiert, um Plasmabestandteile zu eliminieren, während die CTCs mit einem Anti-epitheliales Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) konjugierten magnetischen Ferrofluid eingefangen werden; im zweiten Schritt werden mutmaßliche CTCs mit einem Anti-Zytokeratin-Antikörper weiter gefärbt und identifiziert, während kontaminierende weiße Blutkörperchen (WBCs) durch CD45-Färbung identifiziert werden. Fortschritte in der Einzelzell-Sequenzierungstechnologie erleichtern auch die molekulare Analyse von Zellproben mit seltenen einzelnen CTCs.

3) Einzelne CTCs und CTC-Cluster. Ein CTC-Cluster ist definiert als eine Gruppe von zwei oder mehr CTCs mit stabilen Zell-Zell-Verbindungen, die gemeinsam durch das Blut wandern. Im Vergleich zu einzelnen CTCs zeigten CTC-Cluster unterschiedliche Genexpressionsprofile und Verbreitungsmuster. Die Transkriptomanalyse zeigte, dass CTC-Cluster epitheliale Merkmale aufwiesen. Zell-Zell-Verbindungen spielen möglicherweise eine Schlüsselrolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung des Kreislaufsystems. Gegenwärtig ist die Forschung zu CTC-Clustern ebenfalls in vollem Gange.

1）ctDNA ist in der Regel ein DNA-Fragment, das aktiv von Tumorzellen sezerniert oder während der Apoptose oder Nekrose von Tumorzellen in den Blutkreislauf freigesetzt wird, mit einer Länge von 132-145 bp und einer kurzen Halbwertszeit (in der Regel <2 h). ctDNA trägt genetische Merkmale, die von Tumorzellen stammen, wie z. B. Genmutation, Methylierung, Amplifikation oder Rearrangement, und kann als wichtiger Indikator für das Tumorscreening, die begleitende Diagnose, die Bewertung der Behandlungseffizienz und die prognostische Risikostratifizierung verwendet werden. Die Flüssigbiopsie ist eine minimalinvasive Methode zur Visualisierung der Summe der ctDNA an primären und sekundären Tumorstellen. Es kann nicht nur die Menge der ctDNA quantifiziert werden, sondern es können auch genetische Veränderungen identifiziert werden. Im Plasma verschiedener Krebspatienten wurden spezifische Genmutationen festgestellt, was die ctDNA als möglichen Krebs-Biomarker hervorhebt. Allerdings ist es nicht trivial, nachweisbare ctDNA-Konzentrationen in Körperflüssigkeiten zu erreichen, und ctDNA-Fragmente weisen eine kurze Halbwertszeit auf.。

Der Expertenkonsens über die klinische Praxis der ctDNA-Hochdurchsatzsequenzierung im Jahr 2022 weist darauf hin: Mit der rasanten Entwicklung der Flüssigbiopsie ist es möglich, Körperflüssigkeiten zur Analyse der molekularen Merkmale von Patienten zu verwenden, insbesondere im Hochdurchsatz auf der Grundlage der zirkulierenden Tumor-DNA (ctDNA). Die Next Generation Sequencing (NGS)-Technologie wird in der Klinik immer häufiger eingesetzt, da sie nicht-invasiv oder minimal-invasiv ist, eine kurze Nachweiszeit hat, die Heterogenität des Tumors und der Metastasen widerspiegelt und eine dynamische Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit ermöglicht.

a. Faktoren wie die Art des pathologischen Tumorgewebes, die Lokalisation, das Stadium und die Tumorlast können die Freisetzung von ctDNA beeinflussen. ctDNA-Spiegel sind im Allgemeinen niedriger bei Patienten mit Tumoren mit geringerer Tumorlast, bestimmten Lokalisationen (z. B. intrakraniellen Tumoren) und bestimmten Histologien (z. B. Gliomen) sowie mit geringerer Proliferation, Apoptose und Vaskularisierung.

Im Vergleich zur histologischen Untersuchung hat die ctDNA-Untersuchung den Vorteil, dass sie nicht oder nur minimal invasiv ist, wiederholt Proben entnommen werden können und eine kurze Bearbeitungszeit für Sammlung, Verarbeitung und Analyseberichte haben. Plasma-ctDNA erhöht auch die Nachweisrate von Treibergenmutationen im Vergleich zur Gewebebiopsie allein. Im Vergleich zu Gewebeproben ist der Gehalt an ctDNA in peripherem Blut jedoch geringer, was bei klinischen Tests zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Werden keine Leukozyten als Kontrolle verwendet, kann dies ebenfalls zu falsch-positiven Ergebnissen aufgrund von Keimbahnvariationen oder klonalen hämatopoetischen Mutationen führen. Darüber hinaus gibt es auch Unterschiede in der Menge der ins Blut abgegebenen ctDNA zwischen verschiedenen Tumorpatienten oder demselben Patienten zu verschiedenen Zeiten, was ebenfalls zu Schwierigkeiten beim klinischen Nachweis und der Interpretation von ctDNA führt.

2 Anwendung von ctDNA in der Begleitdiagnostik. Die Begleitdiagnostik (Companion Diagnostics, CDx) gilt als unverzichtbares Instrument der personalisierten Tumormedizin, die voraussetzt, dass die durch die Testergebnisse gelieferten Informationen ausreichen, um die Sicherheit und Wirksamkeit der entsprechenden Therapeutika zu gewährleisten. Patienten, die von einer bestimmten Behandlung profitieren. Die früheste klinische Anwendung des ctDNA-Nachweises als CDx war der Nachweis von Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR), der vor allem dazu diente, Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC zu identifizieren, die von EGFR-TKIs profitieren könnten.

In der ENSURE-Studie wies die ctDNA EGFR 19del- und L858R-Mutationen mit einer Spezifität von 98,2 % und einer Sensitivität von 76,7 % nach; Patienten, die auf der Grundlage der ctDNA-Ergebnisse mit Erlotinib behandelt wurden, hatten im Vergleich zu Patienten, die eine Chemotherapie erhielten, ein signifikant besseres PFS. Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Studie hat die FDA 2016 das erste CDx-Produkt für die Flüssigbiopsie, den Cobas EGFR-Mutationstest v2, zugelassen, gefolgt von der National Medical Products Administration (NMPA) im Jahr 2019, um die Markteinführung dieses CDx-Produkts im Inland zu genehmigen. In der FLAURA-Studie war die objektive Ansprechrate (ORR) von ctDNA T790M-positiven Patienten auf Osimertinib konsistent mit der von Patienten mit positiver Tumorbiopsie. Dies hat eine Welle von Forschungsschwerpunkten für den Nachweis von ctDNA bei minimaler Resterkrankung (MRD) und homologer Rekombinationsstörung (HRD) ausgelöst.

3 Die wichtigsten Punkte der ctDNA-NGS-Nachweistechnologie. Die mittlere Phase der Analyse umfasst zwei Schritte: "Nassexperiment" und "Trockenexperiment". das "Nassexperiment" umfasst die Nukleinsäureextraktion, das Design und die Synthese von Primern oder Sonden, die Vorbereitung der Bibliothek, die On-Board-Sequenzierung usw. Bei der Bibliotheksvorbereitung kann zwischen Hybridisierung und Amplifikation gewählt werden. Die Qualitätskontrolle dieser Phase sollte entsprechende Anforderungen an die Nukleinsäurekonzentration, die Reinheit und die Verteilung der Fragmente bei der Nukleinsäureextraktion stellen und mit der Durchführung übereinstimmen. Das "Trockenexperiment" umfasst jeden Schritt des bioinformatischen Analyseprozesses, und die Qualitätskontrolle in dieser Phase sollte die minimale Sequenzierungstiefe, die durchschnittliche Sequenzierungstiefe, die Gleichmäßigkeit der Abdeckung, den Guanin- und Cytosin-Gehalt (GC), den Qualitätswert für den Basenaufruf, den Vergleich des Qualitätswerts und die On-Target-Rate usw. umfassen, entsprechende Anforderungen stellen und diese einhalten. Die Post-Analyse-Phase umfasst die Interpretation des Testberichts, die Diskussion im molekularen Tumorboard (MTB) und die genetische Beratung

Bibliotheksaufbaustrategien Gezielte Sequenzierungsstrategien für den Nachweis von ctDNA mit NGS-Methoden werden hauptsächlich in zwei Typen unterteilt: Hybrid Capture-basiertes NGS (Hybrid Capture NGS) und Amplifikations-basiertes NGS (Amplification-based NGS). Die Hybrid-Capture-basierte gezielte NGS-Methode ist eine Methode, bei der die Capture-Sonde an eine bestimmte Region im Genom hybridisiert, um die Sequenz der Zielregion zu erhalten und zu analysieren. Diese Methode umfasst viele Arbeitsschritte, und der Prozess ist relativ kompliziert. Es dauert 1 bis 2 Tage, bis die Bibliothek vollständig aufgebaut ist und auf dem Computer angezeigt wird. Es können Punktmutationen, Insertionen und Deletionen von kleinen Fragmenten und Kopienzahlvariationen sowie Genumlagerungen auf DNA-Ebene nachgewiesen werden, und einige unbekannte Fusionen können gefunden werden. die Nachweisempfindlichkeit kann mehr als 95 % erreichen. Die bei der Bibliothekserstellung für die Zielsequenz-Capture-Methode verwendeten Sonden bestehen aus DNA- und RNA-Sonden, die hauptsächlich für die gezielte Anreicherung der Zielregion verwendet werden, um die vollständige Anreicherung der Zielsequenz der Probe zu gewährleisten, die Anreicherungseffizienz und die Einheitlichkeit der Abdeckung zu verbessern und die Sequenzierungskosten effektiv zu senken. Amplikonbasierte zielgerichtete NGS-Ansätze beruhen auf mehreren PCR-Amplifikationsschritten zur Anreicherung der Zielsequenzen. Bei den Experimenten ist die tatsächliche Bearbeitungszeit für die amplifikationsbasierte Bibliotheksvorbereitung in der Regel kürzer als bei den Hybrid-Capture-Methoden. Unabhängig von der verwendeten Methode sollten für jeden Assay klare Kriterien für geeignete Bibliotheken festgelegt werden.

Das Aufkommen der Flüssigbiopsie ist eine Verbesserung des bestehenden Tumornachweissystems. Die Flüssigbiopsie kann Spuren von Tumoren im Körper in einem frühen Stadium nachweisen und ist eine wichtige Methode für die Früherkennung von Tumoren. Im Vergleich zur Gewebebiopsie, die direkt aus dem Tumorgewebe entnommen wird, wird das Material der Flüssigbiopsie aus dem Blut gewonnen, was weniger invasiv und bequem für die Echtzeitüberwachung ist. Der positive Effekt ist eine wichtige Technologie für die Tumordiagnose und -behandlung.

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