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Innovativer Durchbruch: Mausmodell für die schnelle Bewertung der Aktivität von Anti-Mycobacterium tuberculosis-Medikamenten durch Inhalation

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Ein neuartiges, nicht-invasives Mausmodell mit autolumineszierenden M. tuberculosis ermöglicht eine schnelle Bewertung der Wirksamkeit inhalierter Anti-TB-Medikamente durch RLU-Messung.

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Aufgrund der suboptimalen pharmakokinetischen Eigenschaften herkömmlicher oraler oder injizierbarer Verabreichungswege ist die Wirksamkeit der meisten Wirkstoffe gegen Mycobacterium tuberculosis (MTB) häufig durch eine ineffiziente Verteilung und Verstoffwechselung des Medikaments eingeschränkt. Um die lokalen Wirkstoffkonzentrationen in der Lunge zu erhöhen, hat sich die inhalative Verabreichung als Forschungspriorität herauskristallisiert, die eine gezielte Verabreichung zur direkten Erhöhung der Wirkstoffexposition an den Infektionsstellen ermöglicht. Die bestehenden Modelle beruhen jedoch überwiegend auf Wildtyp-MTB-Stämmen, die unter der Komplexität der Arbeitsabläufe, der langen Versuchsdauer, den hohen Arbeitskosten und der schlechten Reproduzierbarkeit leiden.

In dieser Studie entwickelten Tian X, Gao Y, Ma W und Kollegen ein inhalationsbasiertes Bewertungsmodell, das autolumineszente Mycobacterium tuberculosis (AIRv) verwendet. Dieses Modell überwacht die Arzneimittelaktivität dynamisch durch die Quantifizierung der relativen Lichteinheiten (RLU), die von lebenden Mäusen, die mit dem autolumineszenten Stamm infiziert sind, abgegeben werden. Der innovative Ansatz bietet die folgenden Vorteile:

1. Rationalisierte Verfahren: Es ist keine Anästhesie der Mäuse mehr erforderlich, was die Verabreichung von Medikamenten und die Bedienung der Instrumente vereinfacht.

2. Kosteneffizienz: Ersetzt Großtiermodelle durch Mäuse, was die Versuchskosten erheblich senkt.

3. Verkürzter Zeitrahmen: Verkürzt den traditionellen Untersuchungszeitraum von Monaten auf 16-17 Tage.

4. Nicht-invasive Bewertung: Verwendet lebende RLUs als Ersatz für koloniebildende Einheiten (CFUs) und vermeidet Tieropfer.

5. Hohe Durchsatzkapazität: Ermöglicht die gleichzeitige tägliche Verabreichung an sechs Mäuse, mit dem Potenzial für 2-3 Dosen pro Tag.

6. Erhöhte Verlässlichkeit: Objektive RLU-Messungen minimieren das menschliche Eingreifen und verbessern die Reproduzierbarkeit.

Proof-of-Concept-Experimente zeigten, dass inhaliertes Rifampicin, Isoniazid und Ethambutol bei niedrigen Konzentrationen (0,5, 0,5 bzw. 0,625 mg/mL) eine starke Anti-Tuberkulose-Aktivität aufweisen, wobei die RLU-Ergebnisse stark mit der therapeutischen Wirksamkeit korrelieren. Weitere Validierungen bestätigten ein konsistentes Verhältnis (~10:1) zwischen Lungen-RLUs und KBEs, was die RLUs als zuverlässigen Wirksamkeitsindikator bestätigt. Mit dieser Methode wird eine effiziente und präzise Plattform für die schnelle Bewertung der inhalativen Arzneimittelaktivität in vivo geschaffen.

Experimentelle Methoden

1. Stämme und Kulturen:

Der autolumineszente Mycobacterium tuberculosis-Stamm (AIRv), der den luxCDABE-Gencluster trägt, wurde in Middlebrook 7H9-Bouillon kultiviert, bis er die logarithmische Wachstumsphase erreichte (OD600 = 0,6-0,8; RLUs ≈ 5 × 10⁹/mL).

2. Etablierung des Tiermodells

2.1 Infektion: Weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit AIRv über ein Aerosol-Inhalationssystem infiziert und nach dem Zufallsprinzip in Gruppen aufgeteilt (6 Mäuse pro Gruppe).

2.2 Anfängliche bakterielle Belastung: Am Tag 3 (Experiment 1) oder am Tag 1 (Experiment 2) nach der Infektion wurden die Mäuse für die Bestimmung der RLU in der Brust betäubt. Eine Untergruppe von Mäusen wurde euthanasiert, und die Lungenhomogenate wurden auf RLUs und KBEs (über 7H10-Agarplatten mit einer 4-wöchigen Inkubation) analysiert, um die Ausgangsinfektionswerte zu ermitteln.

3. Verabreichung von Inhalationsmedikamenten

Die Medikamente (Rifampicin [RIF], Isoniazid [INH] und Ethambutol [EMB]) wurden in sterilisiertem Wasser gelöst (Dosisbereich: 0,125-10 mg/mL) und täglich mit einem Gerät zur Inhalation nur über die Nase (Tow Systems Nose-Only) vernebelt und verabreicht. Jede Behandlungssitzung dauerte 20-25 Minuten und wurde über 14-15 Tage fortgesetzt.

4. Wirksamkeitsbewertung

4.1 Live RLUs: Die RLUs wurden nicht-invasiv im Brustbereich lebender Mäuse mit einem Luminometer (GLOMAX 20/20) zur dynamischen Überwachung der Arzneimittelwirksamkeit gemessen.

4.2 Endgültige Analyse: Nach dem Experiment wurden die Mäuse euthanasiert. Lungenhomogenat-RLUs und CFUs wurden quantifiziert, um ihre Korrelation zu validieren (ungefähres Verhältnis: 10:1).

5. Pharmakokinetische Studien

5.1 Probenahme: Plasma und Lungengewebe wurden zu bestimmten Zeitpunkten nach der Inhalation entnommen. Die Wirkstoffkonzentrationen wurden mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) bestimmt.

5.2 Berechnung der Parameter: Pharmakokinetische Parameter, einschließlich der Fläche unter der Kurve (AUC) und der Halbwertszeit (t₁/₂), wurden analysiert, um die Wirkstoffretention und -wirksamkeit im Lungengewebe zu bewerten.

Experimentelle Ergebnisse

1. Validierung der Wirksamkeit des Murinomodells

Starke Korrelation zwischen RLUs und KBEs: Die relativen Lichteinheiten (RLUs) des autolumineszenten Mycobacterium tuberculosis (AIRv) in der Lunge wiesen ein konsistentes Verhältnis von etwa 10:1 zu den koloniebildenden Einheiten (CFUs) auf (p<0,0001), was die RLUs als zuverlässigen Surrogatmarker für eine schnelle Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit bestätigt.

2. Bewertung der Medikamentenaktivität

2.1 Einzeldosis-Experiment: Rifampicin (RIF 2 mg/mL), Isoniazid (INH 2 mg/mL) und Ethambutol (EMB 10 mg/mL) reduzierten sowohl die RLUs als auch die KBEs in der Lunge im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle signifikant (p<0,0001).INH in der hohen Dosis (2 mg/mL) tötete die Bakterien nahezu aus, wobei die KBEs gegen Null gingen.

2.2 Dosisabhängige Aktivität: Rifampicin: Nur die höchste Dosis (2 mg/ml) zeigte eine signifikante bakterielle Hemmung (p<0,0001), während niedrigere Dosen (0,5 und 0,125 mg/ml) unwirksam waren. Isoniazid: Sowohl 2 mg/mL als auch 0,5 mg/mL verringerten die bakterielle Belastung signifikant (p<0,0001), während 0,125 mg/mL keine Wirkung zeigten.Ethambutol: Dosen von 10 mg/mL und 2,5 mg/mL verringerten die RLUs und KBEs deutlich (p<0,0001), während die niedrigste Dosis (0,625 mg/mL) eine schwächere Wirksamkeit zeigte (p<0,05).

3. Pharmakokinetische Eigenschaften

3.1 Schnelle Absorption: Rifampicin (2 mg/mL): Die Plasmaspitzenkonzentration (16,65 ± 3,91 μg/mL) und die Lungengewebskonzentration (2,33 ± 0,89 μg/g) wurden innerhalb von 5 Minuten nach der Inhalation erreicht. Isoniazid (0,5 mg/ml): Die Lungenkonzentrationen fielen innerhalb von 30 Minuten auf nahezu nicht nachweisbare Werte, so dass mehrere Tagesdosen erforderlich waren. Ethambutol (10 mg/ml): Die Spitzenkonzentration in der Lunge erreichte 10,94 ± 1,63 μg/g und hielt die wirksamen Werte aufrecht (>10 Stunden).

3.2 Verlängerte Retention: Rifampicin und Ethambutol hielten die wirksamen Konzentrationen im Lungengewebe für 24 bzw. 10 Stunden aufrecht und übertrafen damit deutlich ihre in vitro minimalen Hemmkonzentrationen (MIC).

Schlussfolgerung

Durch die Kombination von autolumineszierenden Bakterienstämmen mit der Technologie der Inhalationsverabreichung ermöglicht dieses Modell eine schnelle und präzise Bewertung der Aktivität von Tuberkulose-Medikamenten. Es steigert die Effizienz der Arzneimittelentwicklung erheblich und bietet entscheidende technische Unterstützung für die Entwicklung neuartiger Therapieschemata.

Tow-Int Tech Nose-Only Inhalation Exposure System

In dieser Studie wurde das proprietäre Nose-Only Inhalation Exposure System von Tow-Int Tech verwendet, um Mäusen inhalative Therapien (z.B. Rifampicin) zu verabreichen. Die Ergebnisse zeigten, dass dieser auf Inhalation basierende Ansatz die therapeutische Wirksamkeit im Vergleich zu den traditionellen oralen oder injizierbaren Verabreichungswegen deutlich erhöht und damit die Effizienz der Arzneimittelentwicklung verbessert.

Das Nasen-Mund-Inhalationssystem ist für die präzise orale/nasale Verabreichung von Medikamenten und Inhalationsexperimente an Labortieren wie Mäusen, Ratten und Meerschweinchen konzipiert. Mit seinem luftdichten Design und der gleichmäßigen Expositionskonzentration ist das System ideal für Inhalationsstudien mit Flüssigkeitsaerosolen, Staubaerosolen, Nanopartikelaerosolen, Rauch und anderen inhalierbaren Wirkstoffen. Es gewährleistet eine konsistente Dosierung bei allen Tieren einer Versuchsgruppe, ermöglicht die Überwachung der Aerosolkonzentration und die Probenentnahme in Echtzeit und verfügt über ein hochpräzises Kontrollsystem, um die Homogenität und Stabilität der Exposition zu gewährleisten.

Darüber hinaus unterstützt das System die Prüfung verschiedener Substanzen, darunter Arzneimittel, Luftschadstoffe (z. B. PM2,5), organische Verbindungen, Industriechemikalien und landwirtschaftliche Stoffe. Es unterstützt verschiedene Versuchsprotokolle wie akute/chronische Exposition, Nieder-/Hochdruckbedingungen und hypoxische/hyperoxische Umgebungen und bietet damit Flexibilität für fortschrittliche toxikologische und pharmakologische Forschung.

Referenzen:

[1]Tian X, Gao Y, Ma W, et al. Establishment of an Inhalation Administration Non-invasive Murine Model for Rapidly Testing Drug Activity against Mycobacterium tuberculosis[J]. bioRxiv, 2024: 2024.02. 27.582260.

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