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Elektroakupunkturbehandlung lindert erfolgreich die COPD-Symptome in experimentellen Rattenmodellen

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das Potenzial hat, in Zukunft als Zusatztherapie für COPD eingesetzt zu werden

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Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist die dritthäufigste Todesursache weltweit, und die derzeitigen pharmakologischen Behandlungen sind mit Nebenwirkungen verbunden. Vor kurzem veröffentlichten die Forscher Lu Liu, Zili Tang und Kollegen eine Studie mit dem Titel "Transcriptomic Insights into Different Stimulation Intensity of Electroacupuncture in Treating COPD in Rat Models" im Journal of Inflammation Research.

Ziel dieser Studie war es, die therapeutischen Wirkungen und molekularen Mechanismen der Elektroakupunktur mit einer Intensität von 1 mA und 3 mA bei COPD in Rattenmodellen zu untersuchen. Durch die Einrichtung von Modellen, die Einteilung in Behandlungsgruppen, die Erfassung mehrerer Parameter und die Omics-Analyse fanden die Forscher heraus, dass beide Intensitäten die Lungenfunktion verbesserten, die Muster der Genexpression jedoch unterschiedlich waren. Sie identifizierten acht Kandidatengene und damit verbundene Signalwege, die neue Ziele und Erkenntnisse für die Elektroakupunkturbehandlung von COPD liefern.

1. Forschungshintergrund

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist durch chronische Entzündung, Zerstörung der Alveolen und Verengung der kleinen Atemwege gekennzeichnet und steht weltweit an dritter Stelle der Todesursachen. Die derzeitigen pharmakologischen Behandlungen sind mit Nebenwirkungen verbunden, während die Elektroakupunktur (EA) eine gewisse Wirksamkeit bei der klinischen Behandlung gezeigt hat. Die Stimulationsintensität ist jedoch nach wie vor nicht standardisiert. Ziel dieser Studie war es, die therapeutischen Wirkungen und Mechanismen von 1mA- und 3mA-Elektroakupunktur bei COPD in Rattenmodellen zu vergleichen und die molekularen Regulationsmechanismen durch transkriptomische Analyse aufzudecken.

2. Experimentelle Methoden

2.1 Versuchstiere und Gruppeneinteilung

Auswahl der Tiere: Männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 12-14 Wochen.

Gruppierung der Tiere: Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen aufgeteilt, die jeweils aus sechs Tieren bestanden: normale Kontrollgruppe (NC), COPD-Gruppe, COPD+1mA-EA-Gruppe (EA-1mA) und COPD+3mA-EA-Gruppe (EA-3mA).

2.2 Etablierung des COPD-Modells und Elektroakupunktur-Behandlung

Etablierung des Modells: Das COPD-Modell wurde durch eine Kombination aus Passivrauchen (CS) und intratrachealer Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) induziert. Die Ratten wurden 12 Wochen lang täglich 2 Stunden lang in einem Ganzkörper-Expositionssystem dem Zigarettenrauch ausgesetzt, wobei die LPS-Injektionen an den Tagen 1, 31 und 61 verabreicht wurden.

Elektroakupunktur-Behandlung: Ab Tag 77 wurde bei den Ratten der Gruppen EA-1mA und EA-3mA zwei Wochen lang täglich 20 Minuten lang EA durchgeführt. Es wurden die Akupunkturpunkte BL13 (Feishu) und ST36 (Zusanli) ausgewählt, mit Nadeleinstichtiefen von 6 mm bzw. 7 mm. Es wurden spärliche und dichte Wellen mit einer Frequenz von 4/20 Hz und einer Intensität von 1 mA und 3 mA angewendet. Die Ratten in der NC- und COPD-Gruppe wurden ohne EA betäubt.

2.3 Bewertungsindikatoren

Bewertung der Lungenfunktion: Die Lungenfunktionsparameter, einschließlich des forcierten Ausatmungsvolumens (FEV), der forcierten Vitalkapazität (FVC) und des FEV/FVC-Verhältnisses, wurden mit einem Lungenfunktionstestsystem für Versuchstiere gemessen.

Histopathologische Untersuchung: Die Morphologie des Lungengewebes wurde mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (HE) beurteilt, und die Entzündungsinfiltration wurde mittels immunhistochemischer Färbung (IHC) nachgewiesen. Das Verhältnis von Alveolarfläche zu interstitieller Fläche (A/S) und die mittlere optische Dichte (IOD/Fläche) von Makrophagen und T-Lymphozyten wurden berechnet.

Indikatoren für Entzündungen und oxidativen Stress: Die Serumspiegel von Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-10 (IL-10) und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) wurden mit einem Enzym-Immunoassay (ELISA) gemessen. Biochemische Kits wurden zur Messung der Superoxiddismutase (SOD), des Malondialdehyds (MDA) und der Glutathionperoxidase (GSH-Px) im Serum und Lungengewebe verwendet.

Transkriptomische Sequenzierung (RNA-Seq) und Analyse: Für die RNA-Seq-Analyse wurde die gesamte RNA aus dem Lungengewebe extrahiert, um differenziell exprimierte Gene (DEGs) zu identifizieren. Es wurden Analysen zur Anreicherung von Genen in der Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) durchgeführt. Die gewichtete Gen-Koexpressions-Netzwerkanalyse (WGCNA) wurde verwendet, um Gen-Koexpressions-Netzwerke zu konstruieren und die Beziehung zwischen Modulen und Merkmalen zu bestimmen.

Validierung durch RT-qPCR und Western Blot (WB): Ausgewählte DEGs wurden auf der mRNA- und Proteinebene mittels RT-qPCR bzw. WB validiert.

2.4 Statistische Auswertung

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt und mit der Software Prism 9.0 analysiert. Für Daten mit Normalverteilung und Homogenität der Varianz wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von t-Tests auf kleinste signifikante Unterschiede (LSD) für paarweise Vergleiche. Bei nicht-normalverteilten Daten wurde der Kruskal-Wallis-Test angewandt. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

3. Experimentelle Ergebnisse

3.1 Auswirkungen der Elektroakupunktur auf Lungenfunktion, Entzündung und oxidativen Stress bei COPD-Ratten

Verbesserung der Lungenfunktion: Im Vergleich zur NC-Gruppe war das FEV/FVC-Verhältnis in der COPD-Gruppe signifikant reduziert, was auf eine schwere Einschränkung des Luftstroms hinweist. Sowohl die EA-1mA- als auch die EA-3mA-Behandlung verbesserten das Verhältnis signifikant, obwohl kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden EA-Gruppen festgestellt wurde.

Histopathologische Veränderungen:

Die HE-Färbung zeigte verdickte Alveolarsepten, Emphysembildung und Infiltration von Entzündungszellen in der COPD-Gruppe. Das A/S-Verhältnis war reduziert, und die Anzahl der Entzündungszellen nahm zu. Die Behandlung mit EA-3mA führte zu einem signifikanten Anstieg des A/S-Verhältnisses, während EA-1mA ebenfalls eine steigende Tendenz zeigte, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Beide Behandlungen hemmten die lokale Aggregation von Entzündungszellen. Die Ergebnisse der IHC-Färbung waren konsistent und zeigten eine signifikante Infiltration von Entzündungszellen in der COPD-Gruppe. Nach der EA-Behandlung war die Zahl der Makrophagen und T-Lymphozyten verringert.

Veränderungen bei Entzündungsfaktoren und Indikatoren für oxidativen Stress:

In der COPD-Gruppe waren die Serumspiegel der proinflammatorischen Zytokine erhöht, die Aktivität der antioxidativen Enzyme war reduziert und die Werte des Lipidperoxidationsprodukts MDA waren erhöht. Die Behandlung mit EA-3mA verringerte signifikant die Werte von IL-6, IL-1β und TNF-α, während sie den Wert von IL-10 erhöhte. Sie steigerte auch die Aktivität von SOD und GSH-Px im Serum und im Lungengewebe und reduzierte die MDA-Werte. Die Behandlung mit EA-1mA hatte eine geringere Auswirkung auf die Zytokinwerte, wobei nur eine gewisse Verbesserung der antioxidativen Indikatoren im Serum beobachtet wurde.

3.2 Ergebnisse der transkriptomischen Analyse

Screening auf differentiell exprimierte Gene:

Die RNA-Seq-Analyse identifizierte insgesamt 1.101 differentiell exprimierte Gene (DEGs). Das hierarchische Clustering zeigte unterschiedliche Genexpressionsmuster zwischen der COPD-Gruppe und der NC-Gruppe, wobei die EA-3mA-Gruppe eine größere Ähnlichkeit mit der NC-Gruppe aufwies, während die EA-1mA-Gruppe eine größere Divergenz zeigte. Die Venn-Diagramm-Analyse ergab, dass im Vergleich zur COPD-Gruppe in der EA-1mA-Gruppe 94 Gene und in der EA-3mA-Gruppe 255 Gene hochreguliert wurden, wobei sich 32 Gene überschnitten. Außerdem wurden 63 Gene, die in der COPD-Gruppe im Vergleich zur NC-Gruppe hochreguliert waren, nach der EA-Behandlung umgekehrt reguliert. Es wurden auch spezifische Gene identifiziert, die nur in bestimmten EA-Gruppen exprimiert wurden, wie Msr1 und Slc26a4, die nur in der EA-1mA-Gruppe herunterreguliert wurden, und Pde3a und Bmp6, die nur in der EA-3mA-Gruppe hochreguliert wurden.

Analyse der funktionellen Annotation:

Die Analyse der Anreicherung von GO- und KEGG-Pfaden ergab, dass die DEGs in der COPD-Gruppe hauptsächlich in den Komplement- und Gerinnungskaskaden, im Phagosom, im zirkadianen Rhythmus und in anderen Pfaden angereichert waren. Die EA-3mA-Gruppe zeigte ebenfalls eine Anreicherung in diesen Pfaden und darüber hinaus eine spezifische Anreicherung in cholinergen Synapsen, glutamatergen Synapsen und Axonführungspfaden. In der EA-1mA-Gruppe waren im Vergleich zur COPD-Gruppe vor allem Signalwege angereichert, die mit Entzündungen und Immunreaktionen in Verbindung stehen, wie z. B. die extrazelluläre Fallenbildung von Neutrophilen, Phagosomen und der Hypoxie-induzierbare Faktor-1 (HIF-1)-Signalweg.

3.3 Ergebnisse der WGCNA-Analyse

Die WGCNA-Analyse unterteilte die 1.101 DEGs in 5 Module. Das MEblue-Modul war negativ mit dem FEV/FVC-Verhältnis und dem Serum-SOD-Spiegel korreliert und positiv mit dem Serum-MDA-Spiegel. Dieses Modul enthielt Gene wie Aqp9, Trem1, Mrc1 und Gpnmb, die in beiden EA-Intensitäten herunterreguliert waren. Die Module MEblue und MEbrown korrelierten negativ mit den Serum-SOD-Spiegeln, wobei Msr1 und Slc26a4 speziell in der EA-1mA-Gruppe wiederhergestellt wurden. Das Modul MEturquoise korrelierte negativ mit den IL-1β-Serumspiegeln und enthielt Gene wie Pde3a und Bmp6, die in der EA-3mA-Gruppe spezifisch hochreguliert wurden. RT-qPCR- und WB-Ergebnisse bestätigten, dass die Expressionstrends dieser Gene mit den Sequenzierungsergebnissen übereinstimmten.

3.4 Auswahl und Analyse der Zielgene

Auf der Grundlage der Analyse und Literaturrecherche wurden Mrc1, Gpnmb, Trem1 und Aqp9 als Zielgene ausgewählt. Diese Gene wurden im COPD-Modell signifikant hochreguliert und nach der EA-Behandlung herunterreguliert. Sie könnten an der Pathogenese der COPD beteiligt sein, indem sie Entzündungen, oxidativen Stress und Gewebeumbauprozesse modulieren, was sie zu potenziellen therapeutischen Zielen für die EA-Behandlung von COPD macht.

4. Schlussfolgerungen der Forschung

Die beiden Stimulationsintensitäten der Elektroakupunktur von 1mA und 3mA induzierten unterschiedliche Genexpressionsmuster im COPD-Rattenmodell, die sowohl gemeinsame als auch spezifische Anreicherungspfade beinhalten. Gene wie Mrc1, Gpnmb, Trem1 und Aqp9 können als potenzielle therapeutische Ziele dienen, aber es sind weitere Forschungen erforderlich, um ihre funktionelle Rolle bei COPD zu untersuchen. Diese Studie liefert transkriptomische Beweise für ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Elektroakupunkturbehandlung bei COPD zugrunde liegen.

Während der Studie wurden mehrere wissenschaftliche Instrumente eingesetzt.

1. Tow-Int Tech-Ganzkörperexpositionssystem (CSM-100C, Tow-Int Tech, Shanghai, China)

Es wird verwendet, um Ratten dem Zigarettenrauch auszusetzen, um das COPD-Rattenmodell zu etablieren.

Verfahren zur Etablierung des COPD-Modells:

Einstellung der Geräteparameter:

Während des Experiments wurden die Ratten in einer Expositionskammer platziert, wo sie nach einem bestimmten Programm einer kontrollierten Zigarettenrauchumgebung ausgesetzt wurden.

Expositionszeit und -zyklen:

Das Experiment dauerte 12 Wochen, in denen die Ratten täglich 2 Stunden lang (in zwei einstündigen Sitzungen) dem Zigarettenrauch ausgesetzt waren. Insgesamt wurden die Ratten dem Rauch von 30 Zigaretten ausgesetzt. Jede Zigarette enthielt 11 mg Teer und 1,1 mg Nikotin.

Simulation des pathologischen Umfelds der COPD:

Indem die Ratten über einen längeren Zeitraum dem Zigarettenrauch ausgesetzt wurden, ahmte das Modell den pathologischen Prozess der COPD nach, der durch chronisches Rauchen beim Menschen verursacht wird. Die schädlichen Substanzen im Zigarettenrauch lösten in der Lunge der Ratten chronische Entzündungen und oxidativen Stress aus, was zu ähnlichen pathologischen Veränderungen in der Lunge wie bei COPD-Patienten führte, wie z. B. Schädigung der Alveolen, Entzündung der kleinen Atemwege und Obstruktion.

Verstärkung der Entzündungsreaktion durch LPS-Injektion:

Zu bestimmten Zeitpunkten (Tag 1, 31 und 61) wurde den Ratten intratracheal Lipopolysaccharid (LPS) injiziert. LPS als Entzündungsstimulans verstärkte die Entzündungsreaktion in der Lunge, wodurch das Rattenmodell den pathologischen Merkmalen der menschlichen COPD näher kam. Dieser Ansatz trug dazu bei, ein stabileres und zuverlässigeres COPD-Tiermodell für die anschließende Erforschung der therapeutischen Wirkungen und Mechanismen der Elektroakupunktur bei der Behandlung von COPD zu schaffen.

2. Tierisches Lungenfunktionstestsystem:

Das System wird zur Beurteilung der Lungenfunktion von Ratten verwendet, einschließlich des forcierten Ausatmungsvolumens (FEV), der forcierten Vitalkapazität (FVC) und anderer Indikatoren, um die Auswirkungen der Elektroakupunktur (EA) auf die Lungenfunktion von COPD-Ratten zu bewerten.

Ablauf der Lungenfunktionstests:

Die Ratten wurden narkotisiert und einem Luftröhrenschnitt unterzogen. Das System ist mit einem Beatmungsgerät ausgestattet, das das Atemmuster der Tiere automatisch steuern kann, so dass verschiedene Lungenfunktionstests durchgeführt werden können.

Überwachte Parameter:

Zu den getesteten Parametern gehören das forcierte Exspirationsvolumen bei 0,1 Sekunden (FEV0,1), das forcierte Exspirationsvolumen bei 0,3 Sekunden (FEV0,3) und die forcierte Vitalkapazität (FVC). Das Verhältnis von FEV zu FVC (FEV/FVC) wird zur Beurteilung der Lungenfunktion berechnet.

Diese Parameter werden verwendet, um den Lungenfunktionsstatus der Ratten zu bewerten und die Veränderungen der Lungenfunktion im COPD-Rattenmodell sowie die Auswirkungen der verschiedenen Intensitäten der Elektroakupunkturbehandlung auf die Lungenfunktion zu verstehen.

Referenz

Liu, Lu, et al. "Transcriptomic Insights into Different Stimulation Intensity of Electroacupuncture in Treating COPD in Rat Models" Journal of Inflammation Research (2024): 2873-2887.

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