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Optogenetik und Ganzkörper-Plethysmographie

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erforschung der Mechanismen der Atemrhythmuskontrolle

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Einleitung

Die Studie mit dem Titel "Dbx1 Pre-Bötzinger Complex Interneurons Comprise the Core Inspiratory Oscillator for Breathing in Unanesthetized Adult Mice" von Nikolas C. Vann et al., die in eNeuro veröffentlicht wurde, untersucht den Mechanismus, durch den Dbx1-abgeleitete pre-Bötzinger Complex (preBötC) Neuronen Atemrhythmen in bewussten erwachsenen Mäusen erzeugen. Mit Hilfe optogenetischer Techniken manipulierten die Forscher präzise die Aktivität von Dbx1 preBötC-Neuronen, die Archaerhodopsin (ein lichtempfindliches inhibitorisches Protein) oder Channelrhodopsin (ein lichtempfindliches erregendes Protein) exprimieren, und untersuchten die Auswirkungen auf das Atemverhalten.

Hintergrund der Forschung

Inspiratorische Atembewegungen bei Säugetieren haben ihren Ursprung in der rhythmischen neuronalen Aktivität im Prä-Bötzinger-Komplex (preBötC) des Hirnstamms. Die genaue neuronale Zusammensetzung des preBötC bleibt jedoch unklar. Es wird angenommen, dass von Dbx1 abgeleitete Neuronen eine wichtige Rolle bei der Erzeugung von Atemrhythmen spielen. Diese Neuronen zeigen bei perinatalen Mäusen rhythmische Entladungen, aber ihre Rolle bei erwachsenen Mäusen ist aufgrund ihrer Beteiligung an der Kontrolle motorischer Muster und nicht-respiratorischer Funktionen noch nicht endgültig geklärt.

Experimentelle Methoden

Versuchstiere

Weibliche Dbx1CreERT2-Mäuse, die Tamoxifen-sensitive Cre-Rekombinase in Dbx1-Vorläuferzellen exprimieren, wurden mit Mäusen gekreuzt, die verschiedene Reportergene tragen. Die neuronale Expression wurde durch Tamoxifen-Behandlung induziert, wobei Wildtyp-Wurfgeschwister als Kontrolle dienten. Alle Experimente wurden vom institutionellen Ausschuss für Tierschutz und Tiernutzung genehmigt und entsprachen den einschlägigen Grundsätzen und Leitlinien.

Vorbereitung der Hirnschnitte und Aufzeichnungen

Neonatale Dbx1;ArchT-Mäuse wurden durch Hypothermie narkotisiert und enthauptet. Hirnschnitte, die das preBötC enthielten, wurden präpariert und in einer Aufzeichnungskammer mit erhöhter Kaliumionenkonzentration perfundiert. Die einatmenden motorischen Leistungen wurden aufgezeichnet, und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen wurden verwendet, um Veränderungen der neuronalen Membranpotentiale zu erfassen.

Virusinjektion und Lichtwellenleiter-Implantation

Adulte Dbx1;ArchT- und Dbx1;CatCh-Mäuse wurden betäubt und einer Kraniotomie unterzogen, um Viren zu injizieren und Lichtwellenleiter zu implantieren. Dbx1;CatCh-Mäuse erhielten Virusinjektionen, um vor der Faserimplantation eine Rekombination auszulösen. Nach der Genesung wurden die Experimente durchgeführt.

Messungen der Atmung

Das Atmungsverhalten wurde mittels Ganzkörperplethysmographie gemessen. Die Mäuse wurden mit Ketotifen leicht sediert oder mit 2 % Isofluran kurz anästhesiert. Die Atmung wurde durch die Messung von Luftstromsignalen über einen Druckkreis und einen Differenzdrucktransducer gemessen.

Optogenetische Manipulation

Die Mäuse wurden Lichtimpulsen unterschiedlicher Intensität (6,8, 8,6 oder 10,2 mW) und Dauer (5 Sekunden oder 100 Millisekunden) ausgesetzt, die in Abständen von mindestens 30 Sekunden abgegeben wurden. Bei jeder Maus wurden mehrere Stimulationen durchgeführt, und die Veränderungen der Atemfrequenz, des Tidalvolumens, der Minutenventilation und der Phasenumstellungseffekte wurden analysiert.

Datenanalyse

Die Atmungsparameter wurden mithilfe der Plethysmographie-Software analysiert. Zum Vergleich der Parameter unter verschiedenen Bedingungen wurden gepaarte t-Tests und andere statistische Methoden verwendet. Die Phasenreaktionskurven wurden durch Gruppierung und Mittelwertbildung der respiratorischen Phaseneffekte von Lichtimpulsen aufgezeichnet.

Histologische Untersuchung

Nach dem Experiment wurden die Tiere perfundiert und das Gewebe fixiert. Die Hirnschnitte wurden mit NeuroTrace gefärbt und unter dem Hellfeld- und dem konfokalen Mikroskop untersucht, um die Platzierung der Faserspitzen zu überprüfen und den Bildkontrast einzustellen.

Forschungsergebnisse

Optogenetische Aktivierung (Dbx1;CatCh-Mäuse)

Die Lichtstimulation der preBötC erhöhte die Atemfrequenz sowohl im narkotisierten als auch im wachen Zustand, hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf das Tidalvolumen oder die Minutenventilation. Wildtyp-Wurfgeschwister zeigten keine Veränderungen. Eine kurzzeitige Lichtstimulation während der Inspirationsphase verlängerte die Inspirationszeit und verzögerte die nachfolgenden Atemzüge (Phasenverzögerung). Während des inspiratorisch-exspiratorischen Übergangs oder der exspiratorischen Phasen beschleunigte die Stimulation die nachfolgenden Atemzüge (Phasenvorschub).

Optogenetische Hemmung (Dbx1;ArchT Mäuse)

Die Lichtinhibition der preBötC reduzierte die Atemfrequenz, das Tidalvolumen und die Minutenventilation sowohl im narkotisierten als auch im wachen Zustand, wobei eine höhere Lichtintensität zu stärkeren Effekten führte, einschließlich Atemstillstand. Wildtyp-Wurfgeschwister zeigten keine Veränderungen. Eine kurzzeitige Lichtinhibition während der frühen Inspiration beschleunigte die nächste Inspiration (Phasenvorlauf) und verkürzte die Inspirationszeit. Bei der frühen Exspiration verzögerte sie die nächste Inspiration (Phasenverzögerung).

Elektrophysiologische Befunde

In neonatalen Dbx1;ArchT-Mausgehirnschnitten verursachte 589-nm-Licht eine Hyperpolarisation von Dbx1 preBötC-Neuronen und unterdrückte die Rhythmusbildung und die motorischen Leistungen. Die Hyperpolarisationseffekte waren überwiegend direkt postsynaptisch und betrafen nur minimal Nicht-Dbx1-Neuronen.

Diskussion

Rhythmus- und Musterbildung

Eine anhaltende Lichtinhibition verringerte die Atemfrequenz und verursachte sogar einen Atemstillstand, was darauf hindeutet, dass Dbx1-Neuronen ein wesentlicher Bestandteil des Kernoszillators sind. Die Verringerung des Tidalvolumens deutet auf ihre Rolle bei der Kontrolle der motorischen Muster hin. Eine anhaltende Lichtstimulation erhöhte die Frequenz signifikant, was sich von anderen Studien aufgrund unterschiedlicher Versuchsbedingungen unterscheidet.

Experimente zur Phasenrückstellung

Sowohl die kurzzeitige Aktivierung als auch die Hemmung wirkten sich auf die Atmungsphase und die Inspirationszeit über die Zyklen hinweg aus, was die Ansicht unterstützt, dass die Dbx1 preBötC-Neuronen Teil des Inspirationsrhythmus-Generators sind.

Ausschluss von unspezifischen Effekten

Die Versuchsanordnung schloss Beiträge von preBötC-Eingangsstörungen, axonalen Terminals oder durchlaufenden Axonen aus, was die Rolle der Dbx1 preBötC-Neuronen bei der Rhythmuserzeugung weiter untermauert.

Die Rolle der Gliazellen

Es ist unwahrscheinlich, dass Gliazellen die Ergebnisse der Hemmungsexperimente beeinflussen. Während die CatCh-Expression in Gliazellen zu den Aktivierungsexperimenten beigetragen haben könnte, deutet der Vergleich der ArchT- und CatCh-Effekte auf eine dominante neuronale Rolle hin.

Größe des Kernoszillators

Obwohl die meisten Dbx1 preBötC-Neuronen nicht-rhythmische Funktionen erfüllen, bildet eine Teilmenge den inspiratorischen Kernoszillator. Zukünftige Studien sind erforderlich, um den Anteil der nicht von Dbx1 abgeleiteten rhythmogenen Neuronen zu quantifizieren und zwischen rhythmogenen und nicht-rhythmogenen Dbx1-Neuronen zu unterscheiden.

Schlussfolgerung

Diese Studie zeigt, dass Dbx1 preBötC-Neuronen die Atemfrequenz und das Atemtiming direkt beeinflussen, was sie als eine Kernkomponente des inspiratorischen Oszillators etabliert. Diese Ergebnisse verbessern unser Verständnis der Atmungsphysiologie und haben Auswirkungen auf die Untersuchung von Atmungsstörungen und die Entwicklung therapeutischer Ziele.

In der Studie verwendete Ausrüstung

Ganzkörper-Plethysmographie-System

Wird zur Messung des Atmungsverhaltens bei sich frei bewegenden Tieren verwendet. Das System erkennt Volumenänderungen, die durch Thoraxbewegungen verursacht werden, und wandelt Drucksignale in elektrische Signale für die Analyse von Atemkurven und die Berechnung von Parametern (z. B. Tidalvolumen, exspiratorischer Spitzenfluss, Atemfrequenz) um.

Optogenetische Ausrüstung

Der 589-nm-Laser (Dragon Lasers) und der 473-nm-Laser (Dragon Lasers) wurden verwendet, um optische Fasern für Dbx1;ArchT- bzw. Dbx1;CatCh-Mäuse anzuschließen und so optogenetische Operationen zu ermöglichen.

Tow-Int Tech Ganzkörper-Plethysmographie-System

Entwickelt für die Untersuchung der Atemfunktion und der Reaktionsfähigkeit der Atemwege bei bewussten, nicht fixierten Tieren. Durch die Kombination von Optogenetik mit fortschrittlichen Atmungsmessungen erleichtert das System die Erforschung der Kontrollmechanismen des Atmungsrhythmus und bietet präzise und zuverlässige Daten für die Untersuchung physiologischer und pathologischer Bedingungen.

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