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#Neues aus der Industrie
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Einsatz der Ganzkörperplethysmographie zur Untersuchung und Überwachung der Hustenmechanismen bei Mäusen
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Ganzkörperplethysmographie für die Erforschung des Hustenverhaltens von Mäusen
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Abstrakt
Husten ist ein wesentlicher Abwehrmechanismus der Atemwege, der dazu beiträgt, Schleim oder Fremdkörper aus den Atemwegen zu entfernen. Unter normalen Bedingungen ist dies eine starke und wirksame physiologische Reaktion. Bei pathologischen Zuständen können die neuronalen Mechanismen, die dieses Abwehrverhalten steuern, jedoch überempfindlich werden, was zu chronischem trockenem Husten führt, der die Lebensqualität stark beeinträchtigt. Obwohl Husten ein häufiger Grund dafür ist, dass Patienten medizinische Hilfe in Anspruch nehmen, sind die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten begrenzt und können zu Medikamentenmissbrauch führen, was vor allem auf ein unzureichendes Verständnis der neuronalen und molekularen Mechanismen zurückzuführen ist, die dem Hustenverhalten zugrunde liegen.
Eine bahnbrechende Studie unter der Leitung des Teams von Professor Luo Fujun am Guangzhou Laboratory, die in eLife veröffentlicht wurde, identifizierte einen Schaltkreis im Hirnstamm, der hustenähnliches Abwehrverhalten der Atemwege bei Mäusen steuert. Der Erstautor, Professor Xu Xiaoshan, nutzte ein sich frei bewegendes Mausmodell, um den neuronalen Schaltkreis im Hirnstamm aufzudecken, der evozierte Atemwegsreflexe vermittelt, und definierte ihn als hustenähnliche Reaktion. Durch den Einsatz mehrerer Techniken zur Kartierung und Modulation neuronaler Schaltkreise entdeckte das Team eine bisher unerkannte Rolle des kaudalen spinalen Trigeminuskerns (SP5C) beim reflexiven Hustenverhalten.
Diese Studie kombinierte Ganzkörper-Plethysmographie (WBP), Audio-Aufnahme und Video-Tracking-Technologien, die von Tow-Int Tech entwickelt wurden, um ein quantitatives Paradigma zur Untersuchung des Hustenverhaltens bei wachen Mäusen zu etablieren. Mit Hilfe von TRAP2-transgenen Mäusen und In-vivo-Faserphotometrie konnten die Forscher nachweisen, dass die neuronale Aktivität in SP5C in hohem Maße mit Hustenreaktionen korreliert, die durch Tussionsmittel ausgelöst werden.
Weitere Experimente zeigten, dass die Hemmung des synaptischen Outputs von SP5C oder die Unterdrückung seiner Aktivität durch chemogenetische Methoden diese Hustenreflexe wirksam ausschalten. Umgekehrt löste die optogenetische Stimulation der erregenden Neuronen des SP5C oder ihrer Projektionen in die ventrale respiratorische Gruppe (VRG) robuste hustenähnliche Verhaltensweisen aus, selbst wenn keine Hustenreize vorhanden waren.
Insbesondere die anhaltende Steigerung der neuronalen Erregbarkeit von SP5C führte bei Mäusen zu chronischem Spontanhusten. Diese Ergebnisse sind ein starker Beweis für die Existenz eines bisher nicht identifizierten Hirnstamm-Schaltkreises (SP5C→VRG), der das Hustenabwehrverhalten bei Mäusen steuert.
Forschungsziele
In dieser Studie wurde der zentrale neuronale Schaltkreis, der das Hustenverhalten steuert, mit Hilfe eines Mausmodells und verschiedener Technologien zur Analyse neuronaler Schaltkreise systematisch identifiziert und validiert, wobei der Schwerpunkt auf der Rolle von SP5C lag.
Materialien und Methoden
Ein multidisziplinärer Ansatz wurde angewandt, um das Hustenverhalten aus der Perspektive des Verhaltens, der neuronalen Aktivität, der Schaltkreiskonnektivität und der funktionellen Modulation zu analysieren.
3.1 Tiermodelle
Für zelltypspezifische Manipulationen wurden transgene Wildtyp- (WT), TRAP2-, Neurexin 1/2/3-Knockout- (Nrxn123 cTKO), VGluT2-IRES-Cre- und GAD2-IRES-Cre-Mäuse verwendet.
3.2 Husteninduktion und Überwachung
Hustenstimuli: Zitronensäure (CA), Capsaicin und Ammoniak (NH₃) wurden vernebelt, um hustenähnliche Reaktionen hervorzurufen.
Überwachungssystem: Die Ganzkörper-Plethysmographie (WBP) zeichnete Veränderungen des Atemluftstroms auf, während Mikrofone und Kameras Hustengeräusche und -bewegungen für eine multimodale quantitative Analyse aufzeichneten.
Definition von Husten: Ein hustenartiges Ereignis wurde durch das charakteristische dreiphasige Atemflussmuster "Inspiration - Kompression - Exspiration" im WBP definiert, das von deutlichen Hustengeräuschen begleitet wurde.
3.3 Überwachung der neuronalen Aktivität
In-vivo-Faserphotometrie: AAV-GCaMP6s wurde in Zielhirnregionen (z. B. SP5C, NTS, VRG) injiziert, um Kalziumsignale zu überwachen und zeitliche Korrelationen mit dem Hustenverhalten zu bewerten.
3.4 Validierung der Erforderlichkeit
Blockade des synaptischen Ausgangs: AAV-Cre wurde in SP5C von Nrxn123 cTKO-Mäusen injiziert, um die synaptische Übertragung bedingt zu blockieren.
Chemogenetische Hemmung: AAV-hM4Di-mCherry wurde in SP5C injiziert, und Deschloroclozapin (DCZ) wurde intraperitoneal verabreicht, um die neuronale Aktivität zu hemmen.
3.5 Ausreichende Validierung
Optogenetische Aktivierung: AAV-ChrimsonR wurde in SP5C injiziert, um exzitatorische Neuronen (CaMKII+) zu stimulieren. Die projektionsspezifische Aktivierung wurde durch Injektion von AAV-Cre in SP5C und AAV-DIO-ChrimsonR in VRG erreicht.
3.6 Verfolgung des Kreislaufs
Anterograde und retrograde trans-synaptische Verfolgung:
Anterograde: AAV-hSyn-EGFP wurde in SP5C injiziert, um axonale Projektionen sichtbar zu machen.
Retrograd: Pseudorabies-Virus (RV) wurde in VRG injiziert, um monosynaptische Eingangsneuronen von SP5C zu markieren.
Doppelvirus-Strategie: AAV2/1-Cre (anterograde) und AAV2/9-DIO-Chrimson-mCherry wurden verwendet, um direkte synaptische Verbindungen zwischen SP5C und VRG zu bestätigen.
3.7 Modell des chronischen Hustens
NaChBac, ein bakterieller spannungsabhängiger Natriumkanal, wurde in SP5C überexprimiert, um die neuronale Erregbarkeit zu erhöhen und spontanen Husten auszulösen.
3.8 Elektrophysiologische Aufzeichnungen
An akuten Hirnstammschnitten wurden Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen durchgeführt, um die neuronalen Eigenschaften von SP5C zu untersuchen (z. B. Aktionspotentialfeuerung, Membranwiderstand).
Ergebnisse
4.1 Etablierung und Validierung des Hustenverhaltensmodells
NH₃, CA und Capsaicin lösten typische hustenähnliche Reaktionen aus, die durch ein dreiphasiges Luftstrommuster und deutliche Hustengeräusche gekennzeichnet waren. NH₃ wurde aufgrund seiner starken und konsistenten Wirkung als primärer Hustenreiz ausgewählt.
Kontrollbehandlungen (Kochsalzlösung) führten zu vernachlässigbarem Husten, was die Spezifität des Modells bestätigt.
4.2 Die neurale Aktivität von SP5C ist stark mit Husten korreliert
Die TRAP2-Markierung zeigte, dass die NH₃-Stimulation Neuronen in SP5C, NTS und VRG aktivierte. Die Faserphotometrie bestätigte, dass die Kalziumsignale im SP5C während Hustenereignissen signifikant zunahmen und mit dem Hustentiming synchronisiert waren.
4.3 SP5C ist für den Hustenreflex notwendig
Die Blockade des synaptischen Outputs im SP5C von Nrxn123 cTKO-Mäusen reduzierte den NH₃-induzierten Husten signifikant. Die chemogenetische Hemmung von SP5C-Neuronen unterdrückte die Hustenreaktionen stark, während die Kontrollen unbeeinflusst blieben.
4.4 Aktivierung von SP5C löst direkt Husten aus
Die optogenetische Aktivierung von VGluT2+ oder GAD2+ Neuronen veränderte nur den Atemrhythmus, ohne Husten auszulösen. Im Gegensatz dazu löste die Stimulierung von CaMKII+ exzitatorischen Neuronen im SP5C robuste hustenähnliche Verhaltensweisen aus, ohne dass ein Hustenreiz ausgelöst wurde.
4.5 SP5C reguliert Husten über direkte Projektionen zum VRG
Tracing-Experimente zeigten direkte Projektionen von SP5C zu cVRG, rVRG und preBötC. Retrogrades virales Tracing bestätigte monosynaptische Verbindungen zwischen SP5C und VRG. Die optogenetische Aktivierung der SP5C→VRG-Projektionen löste Husten aus, wobei die hochfrequente Stimulation effektiver war.
4.6 Erhöhte SP5C-Erregbarkeit induziert chronischen Spontanhusten
Die Überexpression von NaChBac in SP5C führte innerhalb von 3-4 Tagen zu spontanem Husten, wobei die Häufigkeit mit der Zeit zunahm. Diese Mäuse zeigten auch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber NH₃, mit stärkeren und schnelleren Hustenreaktionen. Elektrophysiologische Aufzeichnungen bestätigten eine erhöhte Erregbarkeit und spontane Aktionspotentiale in SP5C-Neuronen.
Schlussfolgerung
In dieser Studie wurde der zentrale neuronale Schaltkreis, der das Hustenverhalten bei Mäusen steuert, systematisch identifiziert und validiert, wobei die entscheidende Rolle von SP5C hervorgehoben wurde.
Die wichtigsten Ergebnisse umfassen:
- **SP5C ist ein zentraler Schlüsselkern für den Hustenreflex**: Seine neuronale Aktivität ist mit dem Husten synchronisiert, seine Hemmung verhindert den Husten, und seine Aktivierung löst den Husten aus.
- **SP5C reguliert VRG direkt über monosynaptische Verbindungen**: Dieser Signalweg bildet die neuronale Grundlage für die motorische Hustenleistung.
- **SP5C-Hyperexzitabilität verursacht chronischen Husten**: Erhöhte neuronale Erregbarkeit von SP5C führt zu spontanem Husten und Hustenüberempfindlichkeit, was Einblicke in die Mechanismen des chronischen Hustens ermöglicht.
- **Mäuse sind ein valides Modell für die Untersuchung neuronaler Mechanismen des Hustens**: Multimodale Technologien bestätigten die Zuverlässigkeit des hustenähnlichen Verhaltens von Mäusen, was die Verwendung von Mäusen in der Erforschung neuronaler Schaltkreise unterstützt.
**Bedeutung und Ausblick**
Diese Studie enthüllt ein bisher übersehenes Hustenregulationszentrum (SP5C) und bietet neue mechanistische Einblicke in chronischen Husten und Hustenüberempfindlichkeit. Sie könnte den Weg für die Entwicklung gezielter antitussiver Therapien ebnen.
【Reference】
Xu X, Nie X, Zhang W, et al. A brainstem circuit controls cough-like airway defensive behaviors in mice. *bioRxiv*, 2024: 2024.09.08.611924.
