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Methylierung ist wichtig

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Ein Leitfaden für Einsteiger in die Bisulfit-Sequenzierung

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Lassen Sie uns über Epigenetik sprechen! Da dies ein recht umfangreiches Thema ist, werden wir uns auf eine Goldstandard-Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung konzentrieren - die Bisulfit-Sequenzierung. In diesem Beitrag werden wir erläutern, wie die Bisulfit-Sequenzierung funktioniert, warum sie in Bereichen wie der Krebsforschung und der Entwicklungsbiologie von Bedeutung ist und was sie zu einem Eckpfeiler in der Erforschung des Epigenoms macht.

Was ist die Bisulfit-Sequenzierung?

Die Bisulfit-Sequenzierung ist der Goldstandard für die Untersuchung der DNA-Methylierung. Methylierung ist ein wichtiger epigenetischer Marker - eine chemische Markierung, die an die DNA angehängt wird, in der Regel an Cytosinbasen (das "C" im DNA-Code). Sie verändert nicht die DNA-Sequenz selbst, sondern beeinflusst, wie Gene exprimiert werden, und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, bei Krankheiten und bei der Reaktion auf die Umwelt. Durch die Bisulfit-Behandlung werden unmethylierte Cytosine chemisch in Uracil umgewandelt (das nach der PCR als Thymin 'T' gelesen wird), während methylierte Cytosine unverändert bleiben, da sie unter Standardbedingungen chemisch resistent gegen diese Umwandlung sind. Indem wir die DNA nach dieser Behandlung sequenzieren und mit dem Referenzgenom vergleichen, können wir genau feststellen, welche Cytosine in der Probe ursprünglich methyliert waren.

Warum ist die Bisulfit-Sequenzierung wichtig?

Sie ist wichtig für die Grundlagenforschung, da sie für die Festlegung der Zellidentität während der Entwicklung, die Regulierung der gewebespezifischen Genexpression und die Methylierungsmuster bei der Inaktivierung des X-Chromosoms und der genomischen Prägung verantwortlich ist. Aber sie ist auch klinisch relevant, da abweichende DNA-Methylierungsmuster mit vielen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, insbesondere mit Krebs, wo sie Tumorsuppressorgene zum Schweigen bringen oder Onkogene aktivieren können. Das Verständnis dieser Muster hilft uns, Krankheitsmechanismen zu verstehen, diagnostische Biomarker zu entwickeln und potenziell neue therapeutische Ziele zu finden. Auch in der Entwicklungsbiologie, der Alternsforschung und bei der Erforschung des Einflusses von Umweltfaktoren auf unsere Gene ist dies von entscheidender Bedeutung.

Wie funktioniert die Bisulfit-Sequenzierung?

Der zentrale Arbeitsablauf umfasst einige wichtige Schritte. Zunächst isolieren Sie die DNA aus Ihrer Probe. Dann folgt der entscheidende Schritt der Bisulfit-Konvertierung - die Behandlung der DNA mit Natriumbisulfit unter speziellen Bedingungen, um die unmethylierten Cytosine in Uracil umzuwandeln. Nach der Umwandlung ist die DNA ziemlich fragil und fragmentiert. Der nächste kritische Schritt ist die PCR-Amplifikation, um genügend Material für die Sequenzierung zu erhalten. Sie müssen diese umgewandelten DNA-Fragmente genau amplifizieren. Schließlich wird die amplifizierte Bibliothek sequenziert, und mit Hilfe von Bioinformatik-Tools werden die Reads wieder an das Referenzgenom angeglichen und der Methylierungsstatus an jeder Cytosinposition bestimmt.

Was sind die Herausforderungen bei der Bisulfit-Sequenzierung?

Bei dieser Methode gibt es einige Herausforderungen, die berücksichtigt werden sollten. Erstens ist die Bisulfit-Behandlung selbst aggressiv und baut einen erheblichen Teil der DNA ab, was oft zu geringen Ausbeuten führt und höhere Input-Mengen erfordert. Zweitens kann der Umwandlungsprozess unvollständig sein, so dass einige unmethylierte Cytosine nicht umgewandelt werden, was zu falsch-positiven Methylierungsergebnissen führt. Drittens, und das ist für den PCR-Schritt sehr wichtig, enthält die DNA-Vorlage nun Uracil. Standard-DNA-Polymerasen mit hoher Termintreue - die Enzyme, die für eine genaue PCR verwendet werden - kommen oft ins Stocken oder halten an, wenn sie auf Uracil-Basen stoßen, da sie diese normalerweise als Schaden erkennen. Dies führt zu einer verzerrten Amplifikation, d. h. einige Fragmente werden viel besser amplifiziert als andere, was die Ergebnisse verzerrt und es schwierig macht, das ursprüngliche Methylierungsprofil genau darzustellen, insbesondere bei Proben mit geringem Probenaufkommen.

Wie lässt sich die Amplifikationsverzerrung durch Uracil überwinden?

Früher mussten sich die Forscher entscheiden: Entweder sie verwenden eine nicht-proofreading-Polymerase, die zwar Uracils lesen kann, aber mehr Fehler macht, oder sie verwenden eine proofreading-Polymerase (high-fidelity), die zwar genau ist, aber an Uracils hängen bleibt, was zu Verzerrungen und geringen Erträgen führt. An dieser Stelle werden Fortschritte in der Enzymtechnologie entscheidend. Wir bei Solis BioDyne haben diese Herausforderung erkannt und eine neuartige High-Fidelity-DNA-Polymerase entwickelt, die speziell zur Überwindung dieses Problems entwickelt wurde.

Was ist die Lösung von Solis BioDyne?

Wir haben kürzlich unsere neue HiFi-Polymerase auf den Markt gebracht - die Solis HiFi Hot Start DNA Polymerase. Sie weist einige einzigartige Modifikationen in der Uracil-Bindungstasche des Enzyms auf und liest im Gegensatz zu Standard-HiFi-Enzymen effizient Uracil-Basen im Templat-Strang, ohne zu blockieren, und behält dabei aufgrund ihrer Korrekturlesefähigkeit eine hohe Genauigkeit bei. Damit wird das Problem der Amplifikationsverzerrung in Bisulfit-Sequenzierungs-Workflows direkt angegangen. Forscher können nun eine High-Fidelity-Amplifikation von Bisulfit-konvertierter DNA erreichen, was zu einer genaueren Erstellung von Methylierungsprofilen, einer besseren Bibliothekskomplexität und zuverlässigen Ergebnissen führt, selbst bei schwierigen Proben mit geringem Input oder degradierten Proben, wie sie häufig in der klinischen Forschung verwendet werden. Dadurch wird das Problem der Amplifikationsverzerrung direkt angegangen und eine einheitlichere Amplifikation von Bisulfit-konvertierter DNA ermöglicht, was zu qualitativ hochwertigeren Daten, besserer Bibliothekskomplexität und höherer Empfindlichkeit bei Proben mit geringem Input führt. Obwohl es einige andere HiFi-Enzyme auf dem Markt gibt, die Uracil-Nukleotide tolerieren, gibt es bereits positives Feedback von Kunden, die Solis HiFi-Polymerase in Bisulfit-Sequenzierungs-Workflows testen, und wir hoffen, dass dies ein wertvolles Werkzeug für Forscher in diesem Bereich ist.