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PCa-Screening der Interaktion menschlicher Proteinbibliotheken

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PCa-Screening der Interaktion menschlicher Proteinbibliotheken

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Prinzip der Komplementarität von Proteinfragmenten PCA-Technologie

Proteine erfüllen ihre Funktionen in der Zelle oft nicht unabhängig, sondern interagieren in der Regel mit anderen Proteinen, um Komplexe zu bilden und so bestimmte Funktionen in einer bestimmten Zeit und an einem bestimmten Ort zu erfüllen. Das Verständnis der Interaktion zwischen Proteinen, insbesondere das Screening von Protein-Protein-Interaktionen in großem Maßstab und mit hohem Durchsatz, und die anschließende Darstellung der Netzwerkkarte der Protein-Protein-Interaktion sind von unersetzlicher Bedeutung, um die Funktion eines Proteins aufzudecken und schließlich den molekularen Mechanismus der verschiedenen Lebensaktivitäten in Zellen zu klären.

Der Proteinkomplementationstest (PCA) ist eine neue Technologie zur intuitiven und schnellen Analyse der Interaktion und Lokalisierung von Proteinen in lebenden Zellen. Der Mechanismus dieser Methode ist folgender: Nur Proteine mit vollständiger Struktur können ihre Funktionen ausüben. Wenn das funktionelle Protein jedoch in eine N-terminale und eine C-terminale Hälfte geteilt ist, kann keine der beiden Hälften allein eine Rolle spielen, aber wenn sie räumlich nahe genug beieinander liegen, können sie sich ergänzen und die ursprüngliche Funktion wiederherstellen. Verbinden Sie die beiden inaktiven Fragmente am N- bzw. C-Ende mit dem Zielprotein. Wenn die beiden Zielproteine interagieren, liegen die beiden Fragmente des segmentierten funktionellen Proteins räumlich nahe beieinander und bilden das Protein mit funktioneller Aktivität neu. Ob das Zielprotein interagiert, lässt sich durch den Nachweis der Aktivität feststellen. Je nach den Erfordernissen verschiedener Experimente werden für die PCA funktionelle Proteine wie Luciferase und fluoreszierendes Protein verwendet.

Merkmale und Vorteile der biologischen PCA-Technologie von Meige

Die PCA-Bibliothek des Unternehmens umfasst 18.000 menschliche Proteine, mit denen schnell und einfach die Proteininteraktion in menschlichen Zellen sowie die Interaktion zwischen pathogenen Proteinen und menschlichen Wirtsproteinen untersucht werden kann. Auf der Grundlage der Proteinfragment-Komplementaritätstechnologie hat das Unternehmen das nationale Erfindungspatent für das Hochdurchsatz-Screening von Protein-Protein-Interaktionen erhalten, das die folgenden Merkmale und Vorteile aufweist:

1. Direkter und in situ Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen.

2. Die Empfindlichkeit ist hoch genug, um die Protein-Protein-Wechselwirkung auf dem Niveau der endogenen Expression nachzuweisen.

3. Es können transiente und indirekte Protein-Protein-Wechselwirkungen nachgewiesen werden.

4. Mit Hilfe von Bioinformatik-Software können wir die Ergebnisse der Shengxin-Analyse einfach und schnell erstellen und die Karte des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks zeichnen

Schritte der biologischen PCA-Technologie von Meige:

1. Klonieren Sie das zu testende Gen in den Expressionsvektor, der das N-terminale Ende des funktionellen Proteins enthält, um das Köderplasmid zu konstruieren;

2. Transformieren Sie das Köderplasmid in Zellen und selektieren Sie die transformierten Zellen;

3. Das Bibliotheksplasmid (das 18000 menschliche Gene enthält und in den Expressionsvektor kloniert wurde, der den C-Terminus des funktionellen Proteins enthält) wurde in die Zellen transformiert, die das Köderplasmid exprimieren;

4. Hochdurchsatz-Screening und Identifizierung von Proteinen, die mit dem Köder interagieren, durch Durchflusszytometrie oder Luziferase-Meldesystem.

5. Die Ergebnisse der Bioinformatik-Analyse liefern die Liste der Proteine, die mit den Köderproteinen interagieren.

6. Vorlage des Versuchsberichts (einschließlich des Versuchsablaufs, der Daten und Diagramme) sowie der Liste der Proteine, die mit den Köderproteinen interagieren.

7. (optional) weitere Überprüfung der mit dem Köder interagierenden Proteine durch PCA oder zelluläre Immunfluoreszenz oder Immunpräzipitation

Der Kunde muss die Genklonierung mit der korrekten Sequenz und den relevanten Informationen bereitstellen. Wenn das Gen des Köderproteins in der Bibliothek des Unternehmens kloniert ist, ist es nicht erforderlich, es zur Verfügung zu stellen.

Zyklus: Der Zyklus des PCa-Screening-Experiments für die Interaktion zwischen den einzelnen Proteinen und der Bibliothek beträgt 90 Arbeitstage.

Nach Abschluss der Dienstleistung einreichen:

1). Technischer Servicebericht (experimenteller Ablauf, Daten und Diagramme)

2). Liste der Proteine, die mit den Köderproteinen interagieren