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COVID-19-Prüfung

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Warum einen schmerzhafteren Nasenabstrich verwenden?

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COVID-19-Tests sind inzwischen in unserem Alltag angekommen, aber viele Menschen haben immer noch große Fragen zu den Prinzipien von Nukleinsäuretests. Warum wird bei Nukleinsäuretests ein Nasenabstrich verwendet? Was ist der Grund dafür? Betrachten wir das Ganze einmal aus der Perspektive des Prinzips.

Die am häufigsten verwendete Technik für Nukleinsäuretests ist die RT-PCR (Quantitative Echtzeit-PCR, Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion), auch qPCR (Quantitative Polymerase-Kettenreaktion) genannt, die in der klinischen Praxis eigentlich eine sehr ausgereifte Technik ist. qPCR (RT-PCR) ist derzeit die bevorzugte Methode zur Quantifizierung von DNA/RNA im Bereich der Molekularbiologie.

Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR ist die qPCR eine Methode, die zur Quantifizierung in Echtzeit fähig ist, d. h. sie kann die genaue Menge der amplifizierten DNA in der Probe in Echtzeit überwachen. Bei der herkömmlichen PCR kann die amplifizierte DNA jedoch erst nach Abschluss der Amplifikation nachgewiesen werden (Endpunktdetektion).

Am Beispiel des COVID-19-Virus kann die virale RNA als Amplifikationsvorlage verwendet, in cDNA revers transkribiert und dann mittels qPCR amplifiziert werden.

In der qPCR-Reaktion wird die zu amplifizierende PCR mit einem fluoreszierenden Treibstoff (üblicherweise SYBR GREEN I) markiert und die Fluoreszenz wird während des gesamten qPCR-Prozesses (30-45 Zyklen) nachgewiesen. Je mehr DNA-Moleküle in der Probe vorhanden sind, desto schneller steigt die Fluoreszenz während des PCR-Zyklus an. Die Intensität des qPCR-Fluoreszenzsignals ist proportional zur DNA-Ausgangsmenge, d. h. je mehr Virus in der Probe vorhanden ist, desto früher wird die Fluoreszenz im Zyklus nachgewiesen. Der Zyklus, in dem das Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden kann, wird als Crossing Point (kurz Cq) bezeichnet.

P2: Das Bild zeigt die qPCR-Amplifikation (die ersten beiden Zyklen) in einem PCR-Gefäß. Bei der qPCR gibt es verschiedene Varianten des Signalmoleküls, und es können verschiedene Methoden für dessen Fluoreszenzmarkierung eingesetzt werden. Die beiden gängigsten Prinzipien sind in der Abbildung dargestellt. Der linke Teil zeigt die 5′-Nuklease-Variante, die den FRET-Mechanismus (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) nutzt, bei dem die Fluoreszenz des Reporter-Fluorophors (R) auf den Quencher (Q) übertragen wird und nicht emittiert wird, solange R und Q zusammen sind (wie bei TaqMan). Wenn die beiden delokalisiert sind (wenn die Sonde während der PCR-Verlängerung durch die 5′-de-Nukleaseaktivität der TaqDNA-Polymerase entfernt wird), kann das R frei fluoreszieren und kann dann nachgewiesen werden. Der rechte Abschnitt stellt eine qPCR-Variante dar, die Interkalationsfluoreszenz (z. B. SYBR Green) verwendet. Es werden spezielle Interkalationsfarbstoffe verwendet, die die Menge der emittierten Fluoreszenz stark erhöhen, wenn sie in dsDNA eingefügt werden.

P3: Dargestellt sind Amplifikationsdiagramme für fünf Proben (S1- S5). Da die DNA in jeder Probe vervielfältigt wird, nimmt die Fluoreszenz bei jedem Zyklus zu. Im obigen Beispiel enthält die Probe S1 die höchste Ausgangsmenge an Ziel-DNA, was zu dem schnellsten Anstieg der Fluoreszenz führt. Probe S4 enthält die geringste Anzahl an anfänglichen Ziel-DNA-Molekülen, während S5 keine Ziel-DNA enthält.

Mit anderen Worten: Je mehr Virus im Nasopharyngealabstrich vorhanden ist, desto leichter lässt sich das neue Coronavirus nachweisen. Daher wird in der klinischen Praxis ein Nasenabstrich verwendet, da die Nasenhöhle im Allgemeinen eine höhere Viruslast aufweist.

Würden Sie also lieber einen Nasenabstrich oder einen Rachenabstrich verwenden? Sagen Sie uns, was Sie denken!