Der magische Ball der Biologie

Die Entdeckung magnetischer Perlen.

1. Die Entdeckung magnetischer Perlen

Die Idee zur Erfindung magnetischer Beads stammt ursprünglich von John Ugelstad, einem Chemiker an der Norwegischen Universität für Wissenschaft und Technologie, der 1976 gleichmäßig magnetisierte kugelförmige Partikel aus Polystyrol als Hauptmaterial herstellte.

1979 Vogelstein et al. berichteten über die Verwendung von Glaspulver als Adsorbens, das verwendet werden kann, um DNA-Fragmente aus Sepharose in Gegenwart hoher Konzentrationen von Natriumiodid zu extrahieren, und später waren Festphasen-Nucleinsäure-Reinigungstechniken auf der Basis von Silicagel und anderen Oberflächenträgern mit hydrophilen Eigenschaften weit verbreitet entwickelten. Das Magnetpartikel-basierte Nukleinsäure-Reinigungsverfahren ist eines davon.

2. Arten von Magnetperlen

Grundstruktur (im Allgemeinen in 3 Schichten unterteilt):

Die innerste Schicht ist Polystyrol (PS).

Die zweite Schicht ist mit einer magnetischen Substanz (normalerweise Fe3O4) umwickelt.

Die äußerste Schicht ist ein durch funktionelle Gruppen (wie Carboxyl-COOH, Hydroxyl-OH) modifiziertes Polymer, das mit Nukleinsäure kombiniert werden kann.

Partikelgröße: Unterschiedliche Größen von Magnetperlen weisen offensichtliche Unterschiede in der Suspension auf. Je kleiner die Aufhängung, desto besser, aber die magnetische Reaktion wird geschwächt. Je kleiner die Größe, desto besser die Aufhängung, aber die magnetische Reaktion wird geschwächt. Im Allgemeinen ist es für kleine Proben mit geringem Nukleinsäuregehalt besser, magnetische Beads mit guter Suspension zu verwenden.

Oberflächenmodifikation (funktionelle Gruppe): -OH/-COOH/-NH4/Protein

Unterschied in der Anwendung (Wirkungsumgebung): Sowohl -OH- als auch -COOH-Magnetbeads können Nukleinsäuren effektiv adsorbieren. Im Allgemeinen sind Kügelchen mit Hydroxyl relativ besser für die Nukleinsäureadsorption in einem chaotropen Salzsystem; Kügelchen mit Carboxyl-Funktionsgruppe sind relativ besser für die DNA- und RNA-Adsorption im PEG-System.

Magnetperlen Puffer: im Allgemeinen organische Lösungsmittel wie Polyethylenglycol (PEG).

3. Prinzip der Magnetperlenmethode

SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization) bedeutet, dass paramagnetische Kügelchen nach Art und Größe selektiv an Nukleinsäuren binden können und zur Isolierung, Reinigung und Reinigung hochreiner Nukleinsäuren verwendet werden können. Diese Technologie kann auf die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), die Sanger-Sequenzierung, qPCR, ddPCR und Microarrays usw. angewendet werden.

Basierend auf der SPRI-Technologie werden im Reaktionssystem der Magnetperlenmethode Nukleinsäuremoleküle (DNA & RNA) von einer linearen in eine kugelförmige Form komprimiert. DNA erfährt dramatische Veränderungen in der molekularen Konformation der DNA, die durch NaCl oder MgCl2 in Gegenwart einer bestimmten Konzentration von PEG gefördert werden. Eine große Anzahl negativ geladener Phosphatgruppen auf dem Phosphatrückgrat bindet an die negativ geladenen magnetischen Carboxylkügelchen auf der Oberfläche. Es wird derzeit angenommen, dass diese Wechselwirkung zwischen negativen und negativen Ladungen auf die Wirkung positiv geladener Salzionen (z. B. Na+) zurückzuführen ist. Die negativ geladene Phosphatgruppe bildet mit der Carboxylgruppe über das dissoziierte Salzion (z. B. Na+) eine "Anion-Kation-Anion"-Salzbrückenstruktur, so dass DNA spezifisch an der Oberfläche der Carboxylkügelchen adsorbiert wird. Wenn der Reaktionspuffer verworfen wird, hydratisiert die Zugabe von Wassermolekülen die Nukleinsäuremoleküle schnell und vollständig und setzt die ionische Wechselwirkung zwischen den dreien frei, wodurch die Reinigung der an den Magnetkügelchen adsorbierten Nukleinsäuremoleküle ermöglicht wird. Unter Verwendung der magnetischen Eigenschaften der magnetischen Beads können DNA-Fragmente gesammelt und durch ein angelegtes Magnetfeld eluiert werden.

- Je länger das DNA-Molekül, desto mehr negativ geladene Phosphatgruppen sind auf seiner Oberfläche exponiert, desto negativer ist das gesamte Molekül geladen, und es ist einfacher, auf der Oberfläche der Magnetkügelchen adsorbiert zu werden, also nur geringere Konzentrationen von PEG und NaCl sind für die Wiederherstellung erforderlich.

- Je kürzer das DNA-Molekül ist, desto höher ist die Konzentration an PEG und NaCl, um die hydratisierte Schicht auf seiner Oberfläche gründlicher zu zerstören und genügend negativ geladene Phosphatgruppen freizulegen, die von den Magnetkügelchen adsorbiert und zurückgewonnen werden können. (d. h. je kleiner das wiedergewonnene DNA-Fragment, desto höher die Konzentration von PEG und NaCl, die hinzugefügt werden muss, und desto größer das Volumen der Magnet-Beads.)