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#Produkttrends
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Sequenzierung während der Synthese
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das Grundprinzip von NGS
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Bei NGS wird die DNA nach dem Zufallsprinzip fragmentiert und gespleißt, um eine Sequenzierungsbibliothek zu erstellen. Durch die Durchführung von Verlängerungsreaktionen an den Zehntausenden von Klonen in der Bibliothek werden die entsprechenden Signale erkannt und schließlich Sequenzinformationen gewonnen.
Das Kernprinzip von NGS ist die Sequenzierung während der Synthese, wie im Folgenden analysiert wird.
Zyklus 1: Reaktionssystem hinzufügen
Einbauen einer Base
Entfernen anderer nicht inkorporierter Nukleotide
Signalerkennung
Zyklus 2 - n: Reaktionssystem hinzufügen, Zyklus 1 wiederholen
11. Vier fluoreszenzmarkierte NTPs werden zu jeder Runde der Sequenzierungsreaktionen hinzugefügt.
mit einer Schutzgruppe abgeschlossen, die entfernt werden kann.
2. In jeder Reaktionsrunde wird nur ein Nukleotid integriert und das Gerät liest das entsprechende Fluoreszenzsignal.
3. Am Ende der Signalablesung werden die Blockierungs- und Fluoreszenzgruppen chemisch entfernt, um die nächste Runde von Sequenzierungsreaktionen einzuleiten.
Derzeit ist Illumina eines der am weitesten verbreiteten Unternehmen auf dem Markt. Die vorbereitete Bibliothek wird in den folgenden Schritten nach dem Prinzip der Basenkomplementärpaarung auf einen speziellen Chip "Flowcell" aufgebracht:
I. Flowcell 8 Lanes, innere Oberfläche → chemisch modifiziert → 2 DNA-Primer → komplementär zur Spleißsequenz der zu sequenzierenden DNA-Bibliothek → kovalent an die Flowcell gebunden, um zu verhindern, dass sie von der Flüssigkeit weggespült wird
II. DNA-Bibliothek: viele DNA-Fragmente, die an beiden Enden mit einer spezifischen DNA-Kreuzung verbunden werden, um eine DNA-Mischung zu bilden → zwei Merkmale, Produktionsmethode → Ultraschall, um die genomische DNA zu unterbrechen, beide Enden mit Enzymen zu füllen, unter Verwendung des Klenow-Enzyms, um eine A-Base am 3'-Ende hinzuzufügen, und dann Ligase, um die Kreuzung zu verbinden → Bildung einer Bibliothek → DNA-Mischung
III. Brücken-PCR: Saatgut der Bibliothek auf den Chip → komplementäre Hybridisierung (DNA-Sequenzen an beiden Enden der Bibliothek sind komplementär zu den Primern auf dem Chip) → Hinzufügen von dNTPs und Enzymen → Erzeugen eines neuen Strangs → Hinzufügen von NaOH-Alkalilösung → DNA-Strang ohne Strang → Belassen des ursprünglichen Strangs → Hinzufügen von neutraler Flüssigkeit, um die Alkalilösung zu neutralisieren → das andere Ende der DNA wird komplementär mit dem zweiten Primer auf der Glasplatte hybridisiert → Hinzufügen von Enzymen und dNTPs → Hinzufügen von Alkali → Hinzufügen von neutraler Flüssigkeit → Wiederholen des Vorgangs zur Amplifikation
IV. Umwandlung der synthetisierten Doppelkette in eine Einzelkette, die sequenziert werden kann → chemische Reaktion → Abschneiden einer bestimmten Gruppe an einem Primer → Alkalilösung wäscht die verbleibende Kette vom Chip → Zugabe von neutraler Lösung mit Sequenzierprimer (mit fluoreszenzmarkiertem dNTP → 3'-Ende wird durch eine Azidgruppe blockiert → ein Zyklus kann nur eine Base verlängern, polymerase → Auswahl des dNTPs, das komplementär zur Base an der ursprünglichen Position ist) → Entfernen des überschüssigen dNTPs und der Enzyme mit Wasser → Auflegen der Base auf das Mikroskop zum Laserscannen → Bestimmung des Basentyps (4 dNTPs) anhand der emittierten Fluoreszenz → Hinzufügen chemischer Reagenzien um die Azidgruppe und die daneben markierte Fluoreszenzgruppe abzuschneiden → die Hydroxylgruppe am 3'-Ende freizulegen → neue dNTPs und neue Enzyme hinzufügen → eine Base wieder verlängern → die überschüssigen Enzyme und dNTPs ausspülen → die Farbe im Laserscan ablesen → den Vorgang wiederholen
V. Index: Markierung an der Verbindungsstelle der Bibliothek; die spezifische Sequenz an der probenspezifischen Verbindungsstelle markiert den Ursprung der Probe
VI. Read-Index: alkalische, nicht-strängige read1-DNA → Hinzufügen einer neutralen Lösung → Hinzufügen des read2-Sequenzierungsprimers (Bindungsstelle neben der Indexsequenz) → Durchführen von 2 Sequenzierungsrunden (in der Regel 6 bis 8 Basen) → Verstehen eines bestimmten DNA-Segments, von dem eine Probe der ursprünglichen
VII. Double-End-Sequenzierung: ein DNA-Strang wird einmal in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung gelesen, wodurch sich die effektive Länge der Sequenzierung verdoppelt
VIII. Umgekehrter Strang: Synthese des komplementären DNA-Strangs → Schneiden der Wurzel des ursprünglichen Strangs mit chemischen Reagenzien → Verbleib des komplementären Strangs → Durchführung einer zweiten Sequenzierung (Hinzufügen von read3-Primern zum Lesen von Basen)