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Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure

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Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure

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1. Einführung in die Extraktion und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Die Nukleinsäureextraktion ist ein grundlegender Bestandteil der Molekularbiologie, da qualitativ hochwertige Nukleinsäure für molekularbiologische Anwendungen unerlässlich ist.

Wir fassen einige der derzeit verwendeten Nukleinsäureextraktionstechniken zusammen und geben Tipps zur Auswahl der richtigen Extraktionsmethode für den jeweiligen Probentyp; wir gehen auch auf die Bewertung der Nukleinsäurekonzentration und -qualität sowie auf häufige Probleme bei der Nukleinsäureextraktion ein.

a. Warum ist eine Nukleinsäureextraktion notwendig?

Die Nukleinsäureextraktion bietet Antworten auf eine große Zahl umfangreicher Forschungs- und Anwendungsbereiche (z. B. Klonierung, qRT-PCR und Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation im Bereich des gesamten Genoms und Transkriptoms), und die gewonnene Nukleinsäure kann auf vielfältige Weise verwendet werden.

Der genaue Forschungszweck bestimmt die Art der zu extrahierenden Nukleinsäure; die Anwendung der Nukleinsäure wirkt sich häufig auf die Wahl der Extraktionsmethode aus. (Beispiel: Eine Standard-Endpunkt-PCR-Reaktion erfordert nicht die gleiche DNA-Qualität wie ein Experiment zur Sequenzierung des gesamten Genoms)

Um die Forschungsmethode zu bestimmen, ist es notwendig, die nachgeschalteten Anwendungen von Nukleinsäuren und alle potenziellen Beschränkungen im Zusammenhang mit der Art der Probe genau zu kennen. (Zum Beispiel ist die Sammlung klinischer Proben oft begrenzt, und die Nukleinsäureextraktion stellt eine Herausforderung dar.)

Obwohl die Methode der Zelllyse je nach Probentyp unterschiedlich ist, bleibt das Grundprinzip der Nukleinsäureextraktion insgesamt dasselbe: Zell- oder Gewebeproben werden lysiert, um Nicht-Nukleinsäure-Verunreinigungen (z. B. Proteine usw.) zu entfernen.

Gründe für die Extraktion von Nukleinsäure:

①Zur Analyse der Genexpression in der Grundlagenforschung und Krankheitsforschung;

②Verfolgung der Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung (z. B. Überwachung des Virustiters während und nach einer antiviralen Behandlung).

③Neue Arten identifizieren und Einblicke in den Evolutionsprozess gewinnen (z. B. Analyse antiker DNA).

④Überwachung und Klassifizierung von Krankheitserregern, die Ausbrüche von Infektionskrankheiten bei Menschen, Tieren und Pflanzen verursachen.

⑤ Überwachung der Lebensmittel- und Wassersicherheit durch mikrobiologische Tests und quantitative Überwachung.

⑥Diagnose von Krankheiten (wie genetische Krankheiten, Krebs, immunologische Defekte).

b. Methode der Zelllyse

Die Zelllyse hängt weitgehend von der Art der Probe ab. Stärkere Gewebe, wie z. B. Pflanzen, erfordern einen höheren Kraftaufwand als Säugetiere.

Zelllyseverfahren werden in drei Kategorien unterteilt: mechanische Lyse, enzymatische Lyse und chemische Lyse.

Die Grundprinzipien der drei Analysemethoden sowie die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden sind im Folgenden dargestellt:

Methode 1: Mechanische Spaltung

Mechanische Lyse: Die Zellmembran wird durch eine äußere Kraft zerstört.

Vorteile:

Hohe Effizienz und schnelle Geschwindigkeit;

Die schnelle Lyse verkürzt die Zeit von der Probenentnahme bis zur Nukleinsäureisolierung, was bei Experimenten zur Genexpressionsanalyse entscheidend sein kann;

Ideal für Proben, die sich nur schwer auflösen lassen (z. B. Pflanzenmaterial, filamentöse Pilze und Hefe).

Benachteiligungen:

Je nach Methode ist die Verarbeitung mehrerer Proben zeitaufwändig (z. B. manuelle Zerkleinerung);

Die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben ist zeitaufwändig und kann das Risiko einer Verschlechterung der Proben erhöhen;

Die mechanische Bearbeitung erzeugt Wärme in der Probe, was zu Proteinaggregation und Nukleinsäureabbau führt; l erfordert einige spezielle Werkzeuge oder Geräte.

Methode 2: Enzymatische Lyse

Zugabe eines Enzyms zum Verdau von Proteinen oder Zellstrukturen, wie z. B. Hefezellwände und filamentöse Pilze.

Vorteilhaft:

Die ideale Methode im Labor, ohne mechanische Spaltgeräte im Prozess;

Selektive Entfernung der Zellwand, wobei der Zellteil für eine andere Lyse-Methode (in der Regel chemische Lyse) übrig bleibt; die Methode ist flexibel, und einige durch mechanische Lyse verursachte Schäden werden vermieden.

Nachteilige Aspekte:

Zeitaufwendig (der Enzymaufschluss kann 1 Stunde dauern) und teuer;

Da enzyminduzierte Zellveränderungen die Genexpression beeinträchtigen können, ist sie für die Genexpressionsanalyse nicht geeignet.

Methode 3: Chemische Lyse

Bei der chemischen Zersetzung werden die Zellen mit einem Detergens gewaschen, das die Lipidmembranen aufbrechen kann, wodurch Zellbestandteile freigesetzt werden. Zusätzlich zu den Detergenzien enthalten chemische Lysepuffer in der Regel chaotrope Salze wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff, die dazu beitragen, die Stabilität neu freigesetzter Nukleinsäureproteine (z. B. Nukleasen) zu verringern und die Nukleinsäuren an die Silikamatrix zu binden. Die genaue Zusammensetzung des chemischen Lysepuffers hängt von der Anwendungsrichtung und dem Probentyp ab.

Vorteilhaft:

Der Preis ist günstig, der Betrieb ist einfach und die Geschwindigkeit ist schnell; es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich.

Nachteile:

Detergenzien, die Zellmembranen zerstören, lösen in der Regel auch andere Zellmembranen auf, wodurch deren Bestandteile freigesetzt werden. Diese Methode eignet sich nicht für die Extraktion von organellen-spezifischen Nukleinsäuren;

Diese Technologie ist zwar wirksam gegen E. coli, aber nicht gegen Gram-positive Bakterien, Pflanzen- oder Pilzzellen, da die harte Zellwand das Eindringen des Detergens in die Zellmembran verhindert;

Die gleichzeitige Zugabe von Detergenz und chaotropem Salz zu E. coli-Proben kann die Fähigkeit zur Unterscheidung von Plasmid-DNA und genomischer DNA beeinträchtigen. Es können jedoch Maßnahmen zur Unterscheidung dieser Typen ergriffen werden, auf die später eingegangen wird.

Chemische Substanzen können für Forscher gefährlich sein.

c. Verstehen der Grundsätze der Nukleinsäureaufreinigung

Nach der Zelllyse wird die Nukleinsäure selektiv von den umgebenden Zellbestandteilen freigesetzt und in einer wässrigen Lösung oder einer geeigneten Pufferlösung für die spätere Verwendung konzentriert. Die Schritte nach dem Zellverständnis werden als Aufreinigung bezeichnet. Da die chemischen Eigenschaften der isolierten Nukleinsäure unabhängig vom Probentyp unverändert bleiben, ist die im Folgenden beschriebene Aufreinigungsstrategie generell auf alle Probentypen anwendbar.

① Spin-Säulen

Diese Methode ist in der Regel eng mit dem Kit verbunden. Durch die Extraktion und Aufreinigung mit Hilfe von Spinsäulen können DNA, Plasmide, RNA und PCR-Produkte schnell und in hoher Qualität gewonnen werden, ohne dass neue Reagenzien hergestellt werden müssen. Die Spinsäule enthält eine feste Matrix aus Kieselgel oder einem proprietären Harz zur selektiven Bindung von Nukleinsäuren.

Typische Arbeitsschritte der Spin Column Extraktion:

A. Halten Sie die lysierte Probe auf der Spinsäule:

Die lysierte Probe wird in einem Bindungspuffer, der chaotrope Salze enthält, gesammelt und auf eine Spinsäule gegeben. Der Bindungspuffer ermöglicht die Abtrennung der Nukleinsäure aus der wässrigen Lösung und die Bindung an die Säulenmatrix.

B. Bindung der Nukleinsäure:

Durch die Zentrifugation wird die gesamte Probe mit der Säulenmatrix in Kontakt gebracht. Die Nukleinsäuren in der Probe binden selektiv an die Säule, während andere zelluläre Bestandteile die Säulenmatrix passieren (dies wird gemeinhin als Durchfluss bezeichnet).

C. Waschen:

Nach der Bindung wird die Säule gereinigt, um alle verbleibenden Verunreinigungen wie Proteine oder Restsalze zu entfernen, die nachgeschaltete Anwendungen ernsthaft beeinträchtigen könnten. Die Anzahl der Waschvorgänge hängt vom jeweiligen Kit ab. Einige Waschpuffer enthalten chaotrope Salze, um Proteine zu entfernen, und einige Puffer enthalten hohe Konzentrationen von Ethanol, um Salze zu entfernen. Die meisten Kits enthalten fast ausschließlich einen Puffer mit Ethanol als Waschschritt, um eine vollständige Entsalzung sicherzustellen.

D. Entfernung des restlichen Ethanols von der Spinsäule:

Nach dem Waschen wird manchmal eine kurze Leerzentrifugation durchgeführt, um Ethanolreste zu entfernen.

E. Elution:

Um die Nukleinsäuren aus der Matrix zu eluieren, fügen Sie eine kleine Menge Wasser oder Elutionspuffer* hinzu und lassen die Säule einige Minuten lang stehen. Seit dem vorherigen Schritt wurde das chaotrope Salz entfernt, und der Elutionspuffer kann die Nukleinsäure rehydrieren und von der Säulenmatrix trennen. Durch einmaliges Zentrifugieren kann die wässrige Lösung mit der Nukleinsäureprobe in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt werden.

*Nukleinsäuren werden normalerweise in einem Puffer aufbewahrt, der Tris und EDTA enthält (TE-Puffer). Die Anwesenheit von EDTA trägt dazu bei, die Nukleaseaktivität zu hemmen. Obwohl TE-Puffer Nukleasen wirksam hemmt, ist der EDTA-Gehalt in TE in der Regel um mehrere Größenordnungen niedriger als der Mg2+-Gehalt.

Vor- und Nachteile von Spin Columns:

Vorteil:

geringe Kosten

Effizient und zuverlässig

Produktion von Nukleinsäuren, die für nachgeschaltete Anwendungen geeignet sind

Nachteile:

Langsam wachsende Stämme haben niedrige Nukleinsäurekonzentrationen

Unvollständige Elution führt zu Nukleinsäureverlusten

Die Bindungskapazität der Spinsäule bestimmt die Gesamtmenge der Nukleinsäure

Plasmid-Spin-Säulen-Kit

Plasmidextraktionskits können Plasmide schnell aus E. coli isolieren und sind eines der am häufigsten verwendeten Kits in molekularbiologischen Labors.

Da sich E. coli leicht chemisch lysieren lässt, kombiniert das Plasmid-Kit die Probenlyse und die Nukleinsäureaufreinigung wie folgt:

A. Die Bakterienzellen werden in einem Zentrifugenröhrchen lysiert, bevor die Zelltrümmer zentrifugiert und ausgefällt werden;

B. Die Konfiguration des Lysepuffers ist so, dass nur die Plasmid-DNA nach der Lyse mit der Spinsäule kombiniert werden kann. Daher kann das Zelllysat durch Zentrifugation sofort auf die Säule aufgebracht werden.

C. Kombinieren Sie das Plasmid, das das Lysat enthält, mit der Spinsäule, und die übrigen Reinigungsschritte sind ähnlich wie bei allen anderen Spinsäulenschemata.

D. Verwenden Sie hochwertige Plasmid-DNA für die Elution in Wasser oder TE-Puffer.

**Die meisten Spinsäulen-Kits unterscheiden während des Lyseprozesses zwischen Plasmid-DNA und genomischer DNA (gDNA). Der Lysepuffer enthält Natriumhydroxid und Natriumlaurylsulfat, um das Plasmid und die gDNA vollständig zu denaturieren. Im nächsten Schritt wird die Probe neutralisiert, und die Plasmid-DNA wird wiederhergestellt. Hochmolekulare gDNA kann jedoch nicht vollständig rekombiniert werden und verheddert sich leicht mit den Proteinen in der Probe, so dass die gDNA nicht an die Spin-Säule gebunden werden kann, was zu ihrer Entfernung führt. In Bezug auf Effizienz und Zuverlässigkeit haben Plasmid-Spin-Säulen-Kits jedoch einige Schwächen. Der Optimierungsstandard des Kits beruht hauptsächlich auf Escherichia coli-Stämmen, wobei langsame oder instabile Stämme eine geringe Ausbeute aufweisen können. Darüber hinaus haben Plasmid-Kits und Spin Column Kits eine begrenzte Bindungskapazität. Je nach Kit liegt die Gesamtwiederfindungsrate zwischen 50 und 100 μg.

Andere Spin Column Kits

Neben der Nukleinsäureextraktion werden Spinsäulen auch für die Aufreinigung und Konzentration von Nukleinsäuren verwendet. Aufreinigungskits können verwendet werden, um nicht umgesetzte Restreagenzien in PCR- oder anderen Enzympräparationsreaktionen zu entfernen und um DNA aus Agarosegelen zu reinigen. Konzentrierte Proben bieten eine größere Flexibilität für viele nachgeschaltete Anwendungen.

Einige kommerzielle Spinsäulen-Kits verfügen über die Funktion des Fragment-Screenings, die die Auswahl geeigneter Fragmentbereich-Kits (z. B. für kleine RNA) je nach Forschungszweck ermöglicht. Dies wird durch Veränderung des Ethanolgehalts in der Pufferlösung erreicht.

Viele Spinsäulen-Kits kombinieren Zelllyse und Nukleinsäureaufreinigung. Wir finden Spinsäulen für die Nukleinsäureabtrennung aus fast allen Arten von Proben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Insekten, Pflanzen, Samen, Pilze, Bakterien, Speichel, Blut, Fäkalien und eingebettete Proben in Paraffin.

② Phenol/Chloroform- und Ethanolfällung

Die Phenol/Chloroform-Extraktionsmethode ist eine Methode, die auf dem Prinzip der unterschiedlichen Löslichkeit beruht, um Nukleinsäuren zu trennen. Die Probe wird einem bestimmten Verhältnis von Phenol/Chloroform-Gemisch ausgesetzt, um die gewünschte Nukleinsäure zu erhalten. Eiweiß ist in Phenol/Chloroform löslich, Nukleinsäure ist in Wasser löslich. Wenn die Phenol/Chloroform-Lösung mit der Probe vermischt wird, werden das Protein und die Nukleinsäure getrennt, was eine Reinigung garantiert.

Für die duale Extraktion von RNA und DNA kann dieser Prozess durch Zugabe von saurem Phenol angepasst werden. Dadurch können überschüssige H+-Ionen mit dem Phosphatgerüst interagieren, was zu einer ungeladenen DNA führt. Die DNA wird in der mit Phenol/Chloroform extrahierten Phenolschicht gelöst, während die RNA aufgrund ihres natürlichen Säuregehalts in der Wasserphase gelöst bleibt. Nach der Zentrifugation können die wässrige und die organische Phase getrennt werden, und jede Phase kann mit Ethanol ausgefällt werden.

Arbeitsschritte der klassischen Phenol/Chloroform- und Ethanolfällung:

A. Kontakt von Phenol und Chloroform:

Die lysierte Probe wird in der Regel durch kräftiges Vortexen mit Phenol/Chloroform vermischt. Durch das Vortexen wird sichergestellt, dass alle organischen Bestandteile vollständig mit dem Phenol/Chloroform-Gemisch interagieren können, um eine vollständige Auflösung und Entfernung zu erreichen.

B. Zentrifugieren: Nach Schritt A sind zwei Phasen sichtbar. Die wässrige Phase mit den Nukleinsäuren befindet sich oben, während die organische Phase am Boden Proteine, Lipide und andere Makromoleküle enthält. Anschließend wird die Probe zentrifugiert, um die beiden Phasen vollständig zu trennen

C. Phasentrennung: Entfernen Sie die Wasserphase vorsichtig mit einer Pipette.

D. Ethanolfällung: Fällung und Reinigung der Nukleinsäure mit Ethanol. Bei der Ethanolfällung werden Salz und Ethanol zugegeben, um die Nukleinsäure in der wässrigen Lösung zu puffern. Das Salz puffert das Zucker-Phosphat-Grundgerüst, und Ethanol verändert die Dielektrizitätskonstante der Lösung. Dadurch kann die Nukleinsäure von der wässrigen Lösung getrennt werden, die durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation abgetrennt werden kann.

E. Resuspension: Wiederauflösen der DNA oder RNA in einem Cluster in Wasser oder TE-Puffer.

Vor- und Nachteile der Phenol/Chloroform-Extraktion:

Vorteile:

Hohe Effizienz, in der Regel höher als die Ausbeute der Spinsäule; ü Geeignet für die Extraktion vollständiger DNA mit hohem Molekulargewicht (z. B. gDNA);

Proben, die in komplexen Lösungen suspendiert sind, eignen sich in der Regel immer noch für diese Methode, und einige flüchtige Verbindungen können mit der Matrix der Spinsäule interferieren;

Für Fettproben (z. B. Hirngewebe) ist die Phenol/Chloroform-Extraktion besser als die meisten Spinsäulen-Kits.

Benachteiligungen:

Bei unsachgemäßer Handhabung sind Phenol und Chloroform schädlich und müssen mit äußerster Vorsicht in einem Abzug gehandhabt werden.

Diese Methode ist zeitaufwändiger als Spin Column Kits und kann zu einer geringeren Ausbeute führen.

Die Spuren von Phenol und Chloroform im Nukleinsäureextrakt können sich negativ auf nachgeschaltete enzymatische Reaktionen wie die PCR auswirken. Wenn dies der Fall ist, muss der Extrakt vor der PCR gereinigt werden. Aus diesem Grund gibt es zahlreiche Kits für die Aufreinigung mit Spinsäulen.

Um die kontaminationsfreie Wasserphase sicher zu extrahieren, ist möglicherweise ein wenig praktische Erfahrung erforderlich.

③Automatische Methoden zur Erhöhung des Durchsatzes

Je nach den verschiedenen Nukleinsäureanwendungen und Probentypen können geeignete Extraktionsmethoden mit hohem Durchsatz ausgewählt werden. Die am häufigsten verwendete Methode ist die Magnetkügelchenextraktion. Bei dieser Technik werden positiv geladene magnetische Beads in die Probe eingebracht, und die DNA wird bei niedrigem pH-Wert mit den positiv geladenen magnetischen Beads verbunden, während die DNA bei hohem pH-Wert freigesetzt wird. Die Beads können mit einem Magneten entfernt werden, und der pH-Wert der Lösung kann leicht angepasst werden, um die gewünschte Nukleinsäure abzutrennen. Diese Technologie ist schnell und effizient, aber die Investition in die Automatisierungsausrüstung kann recht teuer sein. (Das Beschichtungsmaterial der magnetischen Beads ist anders, und das Prinzip ist etwas anders)

d. Schlüsselfaktoren und ihre Auswirkungen auf die Extraktion

Bei der Durchführung der Nukleinsäureextraktion oder -reinigung müssen Sie einige Faktoren wie pH-Wert, Salzkonzentration, Temperatur, Puffervolumen und mögliche Ethanolkontamination genau beachten. Jeder dieser Faktoren hat einen großen Einfluss auf die Ausbeute, die Qualität und die Erfolgsquote der nachgeschalteten Experimente.

1. Ein nicht optimaler pH-Wert oder eine nicht optimale Salzkonzentration können die Ladung der Nukleinsäure verändern, was dazu führt, dass die Nukleinsäure nicht an die Spin-Säule bindet oder dass Phenol/Chloroform die Nukleinsäure versehentlich auflöst.

2. Ein falsches Puffervolumen kann zu einer unvollständigen Lyse, Neutralisierung oder indirekten Verdünnung der eluierten Nukleinsäure führen.

3. Eine Verunreinigung mit Ethanol kann nachgeschaltete Enzymreaktionen hemmen und die Probe aus dem Agarosegel herausschwimmen lassen.

e. Besondere Umstände

1. Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht

Für einige Anwendungen (z. B. Southern-Hybridisierung und einige Sequenzierungsverfahren) ist es erforderlich, intakte hochmolekulare DNA zu extrahieren. Bei der Extraktion von HMWDNA müssen neben den oben genannten Faktoren noch weitere Faktoren berücksichtigt werden:

HMW-DNA wird während des Extraktionsprozesses leicht gebrochen. Scherkräfte (Wirbel, Ultraschall usw.) können zur Zersetzung der DNA-Moleküle führen, so dass nach der Extraktion kürzere Fragmente vorliegen. Um dies zu vermeiden, sollte die Probe nur minimal geschert werden.

Bei Anwendungen, die eine Visualisierung der HMWDNA erfordern, können Lyse und Extraktion in einem Agarosegelpfropfen durchgeführt werden, um die DNA während des gesamten Prozesses zu stabilisieren (z. B. gepulste Feldelektrophorese), wobei das gesamte Chromosom intakt bleibt und durch Elektrophorese visualisiert wird.

Die alkalische Lyse führt häufig zum Verlust von HMW-DNA, da sich die HMW-DNA während des Denaturierungsprozesses irreversibel verheddert.

Wenn Sie eine Spinsäule zur Extraktion von HMW-DNA verwenden, sollten Sie die Bindungskapazität der Säulenmatrix berücksichtigen. Einige Säulen können nur Fragmente mit einer Größe von 10-15 kb verarbeiten, da größere Fragmente aufgrund der engen Bindung nur schwer von der Säule eluiert werden können. Bei größeren Fragmenten kann es notwendig sein, spezielle Säulen mit hoher HMW-Bindung oder manuelle Methoden wie Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung in Betracht zu ziehen.

2.KleineRNAs

Bei der herkömmlichen RNA-Extraktion gehen kleine RNA-Moleküle oft verloren, da herkömmliche Spin-Säulen in der Regel eine Größengrenze von etwa 100 Basenpaaren haben, wobei die Größengrenze weitgehend von der Pufferformulierung abhängt. Kleine RNA-Moleküle sind für das Verständnis biologischer Funktionen äußerst wichtig, weshalb die meisten Kits für die Extraktion und Reinigung von Gesamt-RNA für die Erfassung dieser kleinen RNAs optimiert sind.

2. Bewerten Sie die extrahierte Nukleinsäure

a. Quantifizierung und Qualitätskontrolle

Nach der Nukleinsäureextraktion und -reinigung ist es sehr wichtig, die Konzentration und Qualität der extrahierten Probe zu kennen. Je nach Zweck des nachgeschalteten Experiments können Schwankungen bei diesen Parametern die Ergebnisse stark verändern. Wenn zum Beispiel für jede cDNA-Synthesereaktion nicht genau dieselbe Gesamt-RNA verwendet wird, führt die qRT-PCR-Expressionsanalyse zu unzuverlässigen Daten. Es gibt viele Nukleinsäureauswertungsmethoden, die sich in Zeitaufwand, Kosten und Genauigkeit unterscheiden. Schließlich sollten bei der Auswahl der Methoden auch die Anforderungen der nachgeschalteten Experimente berücksichtigt werden.

Im Folgenden wird ein Überblick über einige der gängigsten Bewertungsmethoden gegeben:

1. agarosegel-Elektrophorese

Die Agarosegel-Elektrophorese basiert auf dem Molekulargewicht und trennt Nukleinsäuren durch eine verfestigte Gelmatrix in Gegenwart eines elektrischen Stroms. Die extrahierte Nukleinsäure wird mit einem parallelen Molekulargewichtsstandard verglichen, der Fragmente mit bekannter Größe und Konzentration enthält.

Vorteile: visuelle Überprüfung der DNA-Qualität; vollständige genomische DNA-Proben werden als vollständige Banden dargestellt; degradierte Nukleinsäuren werden als diffuse Banden dargestellt; ribosomale RNA ist deutlich sichtbar; für die meisten Labors verfügbar; Visualisierung möglicher Kontaminationen (z. B. bei Plasmidreinigungsproben, in denen RNA vorhanden ist).

Benachteiligungen: Es wird nur eine grobe Konzentrationsschätzung geliefert; das Vorhandensein von Verunreinigungen, wie z. B. Salz, in der Probe wird nicht angezeigt.

2. Kapillarelektrophorese

Bei der Kapillarelektrophorese, die manchmal auch als "Labor auf einem Chip" bezeichnet wird, werden Proben durch eine kleine Kapillare gezogen, die von einem Detektor überwacht wird, und der Computer empfängt die Informationen und stellt sie grafisch dar. Die Kapillarelektrophorese eignet sich für die Analyse von Fragmentgröße, Menge und Gesamtqualität der Probe. Diese Technik ist genauer als die herkömmliche Agarose-Elektrophorese und wird in der Regel vor der qPCR zur Bewertung von Nukleinsäuren eingesetzt.

Vorteile: genaue Analyse mehrerer Nukleinsäuretypen; automatische Probenbeladung und Quantifizierung sind genauer als bei der Gelmethode; hohe Empfindlichkeit - kleine und kleinste Proben können erkannt und analysiert werden.

Nachteile: teuer.

3. Spektralphotometrie

Die Spektralphotometrie ist eine schnelle Nachweismethode, die sich auf die Eigenschaften des Lichts stützt, das mit der Probe interagiert, um eine genaue Quantifizierung zu erreichen. Die Probe wird in das Prüfgerät (Spektralphotometer) gegeben, das von Licht verschiedener Wellenlängen durchstrahlt wird, und dann vom Detektor empfangen. Der Detektor liefert Informationen über die Menge und Qualität der Probe, die dann von der Computersoftware umgesetzt werden. Durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm gibt das Verhältnis der beiden Werte Aufschluss über die Reinheit der Probe. Für reine DNA und RNA sollte das Verhältnis 260/280 zwischen 1,8 und 2,1 liegen. Zusätzliche Messungen können bei 230 nm durchgeführt werden. Ein Verhältnis von 230/280 nm unter 2,0 zeigt das Vorhandensein von organischen Verunreinigungen an.

In den letzten Jahren hat sich eine neuartige spektrophotometrische Analysemethode auf Fluoreszenzbasis in molekularbiologischen Labors durchgesetzt. Diese fluoreszenzbasierte Technologie hat eine höhere Empfindlichkeit als die herkömmliche Spektrophotometrie und kann DNA und RNA durch die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen unterscheiden, die nur für DNA und RNA gelten.

Vorteile: genau und schnell; liefert Informationen über das Vorhandensein von Verunreinigungen; die meisten Labors verfügen über Spektralphotometer.

Nachteile: Nicht in der Lage, ein einzelnes Segment zu quantifizieren; teuer.

b. Verbesserung der Nukleinsäurequalität

Trotz unserer großen Bemühungen ist es in der Regel notwendig, zusätzliche Maßnahmen zur Verbesserung der Qualität von Nukleinsäuren zu ergreifen. Im Folgenden werden einige zusätzliche Faktoren beschrieben, die bei der Verbesserung der Qualität von Nukleinsäuren berücksichtigt werden müssen.

1. Verwendung und Lagertemperatur:

Nukleinsäuren werden leicht durch Nukleasen (insbesondere RNase und DNase) abgebaut, und eine Lagerung bei niedrigen Temperaturen kann dazu beitragen, die Enzymaktivität zu hemmen. DNA ist von Natur aus stabiler als RNA und bei höheren Lagertemperaturen resistenter gegen Nuklease-Aktivität.

DNA sollte bei -20°C oder darunter gelagert und während der Verwendung auf Eis gehalten werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen kann zur Fragmentierung von DNA führen, insbesondere von HMW-DNA. Wenn HMW-DNA häufig verwendet wird, sollte sie daher bei 4 °C gelagert werden.

RNA wird leichter durch Nukleasen abgebaut und sollte immer bei sehr niedrigen Temperaturen (-20 bis -80 °C) gelagert und nur bei Bedarf aufgetaut werden.

2. Nuklease-Inhibitor und Reinigungslösung

Das Vorhandensein von Nuklease kann Nukleinsäureproben schnell abbauen. Es ist leicht, Nukleasen von ungeschützten Händen auf die Arbeitsfläche zu übertragen; daher sollten Sie bei der Arbeit mit Nukleinsäuren immer Handschuhe tragen.

Der Arbeitsplatz sollte sauber gehalten und häufig mit Ethanol abgewischt werden, um Nukleasekontaminationen zu entfernen. Es gibt viele kommerzielle Produkte, die eine RNase-Kontamination verhindern können. Viele Forscher fügen dem Wasser für RNA-Arbeiten auch den Ribonuklease-Inhibitor Diethylpyrocarbonat (DEPC) hinzu. Es ist auch ratsam, Glasgeräte vor der RNA-Arbeit mit EDPC zu waschen und zu behandeln.

In den letzten Jahren sind zahlreiche Nukleinsäurestabilisatoren auf dem Markt erschienen. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Reinigungslösungen werden diese Reagenzien direkt der intakten Probe an der Entnahmestelle zugesetzt, um Nukleasen zu hemmen und Nukleinsäuren bis zur Extraktion zu stabilisieren. Obwohl die meisten dieser Reagenzien mit den meisten nachgeschalteten Extraktionskits und Anwendungen kompatibel sind, müssen einige von ihnen vor der Nukleinsäureextraktion von intakten Proben entfernt werden.

3. Verwenden Sie nukleasefreie Verbrauchsmaterialien

Achten Sie bei der Verwendung von Nukleinsäuren darauf, dass alle Verbrauchsmaterialien und Glasgeräte nukleasefrei sind. Kaufen Sie nach Möglichkeit nukleasefreie Röhrchen und Pipettenspitzen mit Filter. Wenn Sie nach der Analyse feststellen, dass die DNA-Ausbeute gering und die Qualität nicht ideal ist, oder wenn die extrahierte DNA Ihre Qualitätsprüfung besteht, Sie aber während des nachgeschalteten Experiments unbefriedigende Ergebnisse erhalten, müssen Sie eine Fehlersuche durchführen.