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Ucp1's BAT - Adipositas - bezogener Mechanismus aufdecken-zu-int

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Tow-Int Tech trägt dazu bei, den Regulierungsmechanismus des Entkopplungsproteins 1 (Ucp1) im braunen Fettgewebe (BAT) aufzudecken und bietet damit potenzielle Angriffspunkte für die Behandlung von Fettleibigkeit und Stoffwechselkrankheiten.

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Kürzlich untersuchten Forscher wie Duo Su und Tingting Jiang den Regulationsmechanismus des Ucp1-Gens im braunen Fettgewebe (BAT). Durch verschiedene experimentelle Methoden identifizierten sie den distalen Enhancer von Ucp1, analysierten seine Auswirkungen auf die Thermogenese und die mitochondriale Funktion und veröffentlichten eine Forschungsarbeit mit dem Titel "Identification of a distal enhancer of Ucp1 essential for thermogenesis and mitochondrial function in brown fat" in der Zeitschrift Communications Biology unter Nature. Diese Studie bietet neue Ansatzpunkte für die Behandlung von Fettleibigkeit und damit verbundenen Stoffwechselkrankheiten.

1. Hintergrund der Forschung

Braunes Fettgewebe (BAT) reguliert die Körpertemperatur durch Thermogenese ohne Frösteln, und das Entkopplungsprotein 1 (Ucp1) ist ein Schlüsselprotein in diesem Prozess. Die dreidimensionale Struktur des Genoms ist entscheidend für die Genexpression, und Enhancer können die Genexpression regulieren. Der durch Enhancer vermittelte Regulierungsmechanismus von Ucp1 bleibt jedoch unklar.

2. Experimentelle Methoden

2.1 4C - seq-Analyse: Durchführung von 4C - seq-Experimenten an interskapulärem braunem Fettgewebe (iBAT) und epididymalem weißem Fettgewebe (eWAT) von Mäusen, um die Chromatin-Interaktionen von Ucp1 zu analysieren und zuverlässige Interaktionsstellen und differentielle Interaktionsstellen zu bestimmen.

2.2 Identifizierung von Enhancern: Analysieren Sie die potenziellen Enhancer von Ucp1 durch Kombination öffentlicher Datensätze. Überprüfen Sie ihre Aktivitäten durch Luciferase-Reporter-Assays und analysieren Sie die Histon-Modifikationen und Chromatin-Interaktionen in den Enhancer-Regionen.

2.3 Funktionelle Studien: Verwendung des CRISPR - dCas9 - KRAB-Systems zur Hemmung der Enhancer und Ermittlung von Indikatoren wie Ucp1-Expression, mitochondriale Funktion und Lipidstoffwechsel. Untersuchung der regulatorischen Auswirkungen verwandter Proteine und Faktoren auf die Enhancer durch Methoden wie RNA-Interferenz und ChIP - qPCR. In vivo hemmen Sie den Ucp1-Enhancer in iBAT durch Lentivirus-Injektion und beobachten die Auswirkungen auf die Körpertemperatur der Maus, den Energiestoffwechsel und die mitochondriale Funktion.

Durch Methoden wie RNA-Interferenz (siRNA - vermittelte Ausschaltung von RAD21) und 3C - qPCR untersuchen wir die regulatorische Wirkung der durch Kohäsin vermittelten Chromatinschleife auf die Interaktion zwischen Ucp1 - En4 und dem Ucp1-Promotor. Die Analyse der Hi-C-Daten zeigt, dass sich die beiden in derselben TAD befinden. Nach dem Ausschalten von RAD21 nimmt die Stärke der Interaktion zwischen Ucp1 - En4 und dem Ucp1-Promotor ab, und die Ucp1-Expression nimmt ebenfalls deutlich ab, was darauf hindeutet, dass Cohesin für diese Interaktion und die Regulierung der Ucp1-Expression entscheidend ist.

Verwenden Sie Methoden wie ChIP - qPCR, um die regulatorischen Auswirkungen von EBF2 und CBP auf die Aktivität des Ucp1 - En4 Enhancers zu untersuchen. Durch DNA-Pull-Down- und ChIP-Seq-Analysen wurden die Transkriptionsfaktoren identifiziert, die an Ucp1 - En4 binden. ChIP - qPCR verifizierte die Bindung von EBF2 und CBP und ihre Auswirkungen auf den H3K27ac-Spiegel. Luziferase-Reporter-Assays zeigten, dass die beiden Faktoren die Transkriptionsaktivität von Ucp1 - En4 synergistisch erhöhen, und dieser Regulationsmechanismus ist bei Mäusen und Menschen konserviert.

Es werden die experimentellen Ergebnisse der Hemmung von Ucp1 - En4 in iBAT in vivo vorgestellt. Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigte die erfolgreiche Infektion mit dem Lentivirus. qRT - PCR und Western Blot wurden verwendet, um die Expressionsänderungen von Ucp1 und mit der Lipogenese verbundenen Genen nachzuweisen. Mit Hilfe von Stoffwechselstudien und Infrarot-Bildgebung wurden Indikatoren wie der Sauerstoffverbrauch der Maus, die Thermogenese und die Körpertemperatur analysiert. Es wurde festgestellt, dass die Hemmung von Ucp1 - En4 die iBAT-Thermogenese beeinflusst, nicht aber den Ganzkörper-Energieverbrauch. Mittels Transmissionselektronenmikroskopie und qPCR wurden die Morphologie und Funktion der Mitochondrien untersucht, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale Funktion unter kälteadaptierten Bedingungen beeinträchtigt ist.

3. Experimentelle Ergebnisse

3.1 Merkmale der Ucp1-Chromatin-Interaktionslandschaft: Es gibt Unterschiede bei den Ucp1-Chromatin-Interaktionen zwischen iBAT und eWAT. Es gibt mehr Interaktionsstellen in iBAT, und einige Stellen sind in iBAT hochreguliert. Es wurden vier iBAT-spezifische Ucp1-aktive Enhancer identifiziert, von denen drei durch Kältestimulation aktiviert werden.

3.2 Funktionelle Überprüfung der Enhancer: Ucp1 - En4 und Ucp1 - En6 können die Ucp1-Expression in braunen Adipozyten regulieren. Die Hemmung dieser beiden Enhancer reduziert die Ucp1-Expression, beeinträchtigt die mitochondriale Funktion, führt zu einer Zunahme der Größe der Lipidtröpfchen und zu einer Zunahme der Expression von mit der Lipogenese verbundenen Genen.

3.3 Regulierungsmechanismus: Die Interaktion zwischen Ucp1 - En4 und dem Ucp1-Promotor wird durch eine Chromatinschleife reguliert, die durch Kohäsin vermittelt wird, und die Untereinheit RAD21 ist daran beteiligt. EBF2 und CBP regulieren synergistisch die Aktivität von Ucp1 - En4, und dieser Mechanismus ist bei Mäusen und Menschen konserviert.

3.4 In-vivo-Ergebnisse: Die Hemmung von Ucp1 - En in iBAT in vivo reduziert die Ucp1-Expression, beeinträchtigt die thermogene Kapazität und die mitochondriale Funktion von iBAT und senkt die Körpertemperatur von Mäusen, hat aber keinen Einfluss auf den Ganzkörper-Energieverbrauch.

4. Bedeutung der Forschung

Diese Studie deckt den Regulationsmechanismus von Ucp1 in BAT auf, identifiziert wichtige Enhancer, liefert potenzielle Angriffspunkte für die Behandlung von Fettleibigkeit und Stoffwechselkrankheiten und vertieft unser Verständnis des molekularen Mechanismus der Thermogenese in braunem Fett.

5. Für das Experiment verwendete Instrumente

5.1 Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform: Sequenziert die 4C-Seq-Bibliothek, um die Chromatin-Interaktionen von Ucp1 in iBAT und eWAT zu analysieren, die Interaktionsstellen und Unterschiede zu bestimmen usw. und so die Grundlage für die weitere Forschung zu schaffen.

5.2 Mikroplatten-Luminometer: Misst die Luziferaseaktivität und spielt eine Rolle im Experiment, um die Aktivität von potenziellen Ucp1-Enhancern zu bewerten. Die Wirksamkeit des Enhancers wird durch den Nachweis der Luciferaseaktivität beurteilt.

5.3 Quantitatives Fluoreszenz-Echtzeit-PCR-Gerät: Führt qRT-PCR-Experimente durch, um die Genexpressionsniveaus zu ermitteln, z. B. die Expression von Ucp1, Rad21 und Lipogenese-verwandten Genen (Acly, Acaca, Fasn) usw., um die Auswirkungen verwandter Faktoren auf die Genexpression zu analysieren.

5.4 Bildverarbeitungs- und Analysesoftware: Beobachtet iBAT-Proben mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie, um die Morphologie und Struktur der Mitochondrien zu erkennen. Es wurde festgestellt, dass nach der Hemmung von Ucp1 - En4 unter bestimmten Bedingungen die Mitochondrien geschwollen und die Cristae unregelmäßig waren, was auf eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion hinweist.

5.5 Transmissionselektronenmikroskop: Führt Fluoreszenzaufnahmen bei Tieren durch. Nachdem die Mäuse mit dem Lentivirus infiziert wurden, beobachtet es die Infektion und die Expression des Virus in iBAT, um die Wirksamkeit des Versuchs zu bestätigen.

5.6 Tierisches Energiestoffwechsel-Überwachungssystem (Tow-Int Tech Modell: EM - 8M - WA) Misst den Ganzkörper-Energiestoffwechsel von Mäusen, einschließlich Indikatoren wie Sauerstoffverbrauch (VO₂) und Thermogenese, um die Auswirkungen von Ucp1 - En4 auf den Gesamtenergiestoffwechsel von Mäusen zu untersuchen.

5.7 Infrarot-Wärmebildkamera: Sie nimmt Wärmebilder von Mäusen auf und analysiert sie mit Hilfe einer Software, um Veränderungen der Körpertemperatur von Mäusen festzustellen. Es wurde festgestellt, dass nach der Hemmung von Ucp1 - En4 die Hauttemperatur auf dem Rücken und die rektale Temperatur der Mäuse sank, was auf den Einfluss von Ucp1 - En4 auf die Regulierung der Körpertemperatur hinweist.

6. In der Studie wird ein tierisches Energiestoffwechselsystem (Tow-Int Tech) verwendet.

Es dient zur Messung des Ganzkörper-Energiestoffwechsels von Mäusen, einschließlich Stoffwechselparametern wie Sauerstoffverbrauch (VO₂), Kohlendioxidausstoß (VCO₂), Atmungsaustauschverhältnis, Nahrungs- und Wasseraufnahme. Es kann Mäuse über einen langen Zeitraum in ihrem natürlichen, aktiven Zustand überwachen.

Experimentelle Methoden

Die Mäuse werden in Stoffwechselkäfigen in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit untergebracht. Die Raumtemperatur wird auf 4 °C oder 30 °C eingestellt, die relative Luftfeuchtigkeit beträgt 50 %, und der Hell-Dunkel-Zyklus beträgt 12 Stunden. Vor der Beobachtung müssen die Mäuse 24 Stunden lang in den Stoffwechselkäfigen akklimatisiert werden. Nach der Akklimatisierung messen Sie mit dem Tier-Stoffwechselüberwachungssystem den Sauerstoffverbrauch und die Thermogenese der Mäuse, um den Energiestoffwechselstatus der Mäuse unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten und so die Auswirkungen verwandter Gene oder Enhancer auf den Energiestoffwechsel der Mäuse zu untersuchen. Bei der Untersuchung der Auswirkungen von Ucp1 - En4 auf den Ganzkörper-Energiestoffwechsel von Mäusen ist beispielsweise zu beobachten, ob sich die Energiestoffwechselindikatoren von Mäusen nach der Hemmung von Ucp1 - En4 durch dieses System ändern.

Referenz

Su, D., Jiang, T., Song, Y. et al. Identification of a distal enhancer of Ucp1 essential for thermogenesis and mitochondrial function in brown fat. *Commun Biol* 8, 31 (2025). https://doi.org/10.1038/s42003 - 025 - 07468 - 3

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