Manuell vs. automatisiert, was ist für die Zellzählung zu wählen?

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Die Zellkultur ist ein entscheidender Schritt in der zellbiologischen Forschung. Um ein gesundes Zellwachstum zu gewährleisten und nachgelagerte Experimente zu erleichtern, müssen Forscher die Zellwachstumskurve bestimmen und ihren Wachstumsstatus während der Zellkultur verstehen, daher müssen Zellkonzentration, Lebensfähigkeit und Konzentration vor nachgelagerten Experimenten gemessen werden. Typische Zellzählverfahren umfassen manuelles Zählen und automatisiertes Zählen.

Dieser Artikel stellt die Vor- und Nachteile der manuellen Zellzählung und der automatisierten Zellzählung vor, zusammen mit einer detaillierten Einführung dieser beiden Methoden.

Vor- und Nachteile der manuellen und automatisierten Zelle

Zählen

Methode

Manuelle Zellzählung

Zählzeit: 5min/Probe

Einzelzählgenauigkeit: Niedrig

Cluster-Stichprobenanalyse: Grobe Berechnung

Biologische Gefahr: Ja

Sekundäre Berechnung: Ja

Gesichtsfeldbereich: 1 qm. Mm

Datenverwaltung: Handbuch

Verbrauchskosten: Niedrig

Arbeitskosten: Hoch

Automatisierter Zellenzähler

Zählzeit: 9 Sek./Probe

Einzelzählgenauigkeit: Hoch

Cluster-Probenanalyse: Genaue Trennung

Biologische Gefahr:Nein

Sekundäre Berechnung:Nr

Sichtfeldbereich: 3,5 mm²

Datenverwaltung:Automatisiert

Verbrauchsmaterialkosten: Etwas höher

Arbeitskosten: Niedrig

Manuelle Zellzählung

Die manuelle Zellzählung, im 18. Jahrhundert von dem französischen Anatomen und Histologen Louis-Charles Malassez entwickelt, gilt seit langem als Goldstandard für die Messung der Zellkonzentration.

Verfahren zur manuellen Zellzählung durch Hämozytometer

1 Zellen ernten und färben

Ernten Sie die Zellsuspension und färben Sie sie mit Trypanblau oder AO/PI-Farbstoffen.

2 Reinigen Sie das Hämozytometer

Reinigen Sie das Hämozytometer und trocknen Sie es dann an der Luft oder verwenden Sie einen Trockner. Und Sie können auch organische Lösungsmittel wie 95 % Ethanol, Ethanol absolut oder Aceton wählen, um es zu dehydrieren. Achten Sie darauf, das Hämozytometer nicht mit etwas Hartem zu schrubben.

3 Positionieren Sie das Deckglas und laden Sie dann die Probe

Legen Sie das entsprechende Deckglas über das Hämozytometer, um eine Zählkammer zu bilden. Einen Tropfen der Zellsuspension auf den Rand des Deckglases pipettieren und die Zellsuspension sanft und gleichmäßig in die Kammer fließen lassen, dabei Blasen vermeiden.

4 Mikroskopische Beobachtung und Positionierung

Finden Sie ein geeignetes Sichtfeld unter dem Mikroskop und beobachten Sie die Zellprobe. Passen Sie den Fokus an, um eine klare Sicht zu erhalten und das Zielquadrat zu finden. Verwenden Sie bei Verwendung von AO/PI-Farbstoff ein Fluoreszenzmikroskop zur Beobachtung.

5 Manuelles Zählen unter dem Mikroskop

Betrachten Sie die Probe unter dem Mikroskop und zählen Sie die Anzahl der Zellen manuell. Diese Zählung wird unter Berücksichtigung unterschiedlich großer Zellen dreimal wiederholt und der Mittelwert gebildet.

6 Berechnen Sie die Konzentration

Berechnen Sie die Zellkonzentration in der Probe anhand der Umrechnungsformel und der aufgezeichneten Daten. Wenn Trypanblau-Färbung verwendet wird, trennen Sie lebende Zellen von Gesamtzellen.

7 Reinigen Sie das Hämozytometer

Reinigen Sie das Hämozytometer wie oben beschrieben und bewahren Sie es für eine spätere Verwendung auf.

Anwendungsszenario Manuelle Zellzählung

Zellzählung mit niedrigem Durchsatz

Anmerkungen

● Bei gelegentlicher Reinigung des Hämozytometers können biologische Gefahren entstehen.

● Aufgrund des Materials des Hämozytometers können Oberflächenkratzer die Versuchsergebnisse ernsthaft beeinträchtigen.

● Zurückgelassene Verunreinigungen können eine ungleichmäßige Zellverteilung verursachen.

● Rückstände von Reinigungsmitteln können die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen.

● Wenige geclusterte Zellen sollten als eine Zelle gezählt werden, während Proben mit mehr Clustern resuspendiert und gemessen werden müssen.

● Das Zählprinzip für auf die Gitterlinien gedrückte Zellen sollte im Voraus festgelegt werden.

Automatisierte Zellzählung

Obwohl die Blutzellen-Zähltafel als Goldstandard für die Zellzählung gilt, gibt es inhärente Probleme mit ihrer Konstruktion und Verwendung. Automatisierte Zellzähler wurden entwickelt, um diese Probleme zu überwinden.

Es gibt drei gängige Arten von automatisierten Zellzählern: auf Sicht basierende automatisierte Zellzähler, Zellzähler vom Coulter-Typ und Durchflusszytometer.

Von diesen liefert der bildbasierte automatische Zellzähler aufgrund seiner hohen Zählgeschwindigkeit und ähnlicher Prinzipien ähnliche Ergebnisse wie die manuelle Zählung, die heute der Goldstandard ist. Der automatisierte Zähler kann Zellen und Partikel erkennen und dann Algorithmen anwenden, um Zellkonzentration, Größe und andere Parameter zu messen. Dies ermöglicht die Bestimmung der Zellaussaatkonzentration und -anzahl sowie der Zelllebensfähigkeit und -proliferation.

Verfahren zur automatisierten Zellzählung

(1) Zellen ernten und färben.

(2) Laden Sie die Probe auf einen Einweg-Zählobjektträger.

(3) Führen Sie den Objektträger in das Instrument ein.

(4) Das Gerät zeigt die Zählergebnisse sofort an.

Automatisierte Zellzählungsanwendungen

Hochdurchsatz-Zellzählung.

Automatisierte Zellzähler können mit verschiedenen Arten von optischen Geräten verwendet werden und können daher zu automatisierten Fluoreszenz-Zellzählern für direkte AO/PI-Doppelfluoreszenz aufgerüstet werden.

Anmerkungen

(1) Zählparameter sollten basierend auf der Probe eingestellt werden.

(2) Der Vorverdünnungsmultiplikator sollte vorab eingegeben werden.

(3) Die Genauigkeit des Autofokus sollte überprüft und jede Abweichung sofort korrigiert werden.

Zusammenfassung

Die manuelle Zellzählung mit einem Hämozytometer ist oft fehleranfällig. Außerdem kann eine unsachgemäße Reinigung des Hämozytometers eine biologische Gefahr darstellen. Im Vergleich dazu ist die automatische Zellzählung der manuellen Zellzählung in Bezug auf Datengenauigkeit und Geschwindigkeitseffizienz überlegen. Darüber hinaus empfiehlt das United States Pharmacopeia-National Formulary (USP-NF) die Verwendung von mindestens zwei oder mehr Methoden zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit nach der Gewinnung. Neben der Hellfeld-Trypanblau-Färbung wird die AO/PI-Färbemethode häufig für die fluoreszenzbasierte Zählung lebender Zellen verwendet. Daher ist ein automatisierter Zellzähler mit Fluoreszenzfunktionen sowohl für die Hellfeld- als auch für die fluoreszenzbasierte Zellzählung bequemer und eignet sich daher besser für aktuelle zellbiologische Forschungsszenarien.