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Wie geht man mit der Mikroinjektion von Caenorhabditis Elegans um? Verpassen Sie nicht die Schritt-für-Schritt-Details!

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Die Mikroinjektion von C. Elegans ist die wichtigste Technik im C. Elegans-Forschungsparadigma. Sehen Sie sich die Details des experimentellen Verfahrens Schritt für Schritt an!

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Hintergrund der Mikroinjektion von C. elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein wichtiger Modellorganismus, der für das Studium der Tiergenetik, Ontogenese und Ethologie verwendet wird. Er kann uns dabei helfen, die Wirkungsmechanismen von der molekularen und zellulären Ebene bis hin zur systembiologischen Ebene im Hinblick auf den entsprechenden Lebenszyklus zu untersuchen. Bei der Mikroinjektionstechnik wird ein kapillares Glasrohr mit einem Spitzendurchmesser von wenigen Millimetern für die Injektion von Nukleinsäuren in die Keimdrüse des Wurms verwendet, die anschließend von den Eizellen aufgenommen und in Form von extrachromosomalen Arrays erzeugt werden. Die Mikroinjektion von C. elegans ist die wichtigste Technik in der C. elegans-Forschung. Sie wird häufig zur Untersuchung der Genexpression, der Genfunktion und der genetischen Interaktionen im Körper von C. elegans eingesetzt.

C Elegans Mikroinjektionsprotokoll

Schritt 1: Vorbereitung der Agarplatten

Geben Sie 50 μm einer 2%igen heißen Agaroselösung auf ein 24 × 60 mm großes Deckglas und legen Sie vorsichtig ein weiteres Deckglas darauf (achten Sie auf die Luftblasen). Nachdem die abgeflachte Agarose erstarrt ist (~5 min), können Sie das Deckglas durch vorsichtiges Gleiten entfernen. Lassen Sie die Agarplatte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen oder backen Sie sie 1 Stunde lang bei 80℃. Stapeln Sie die Platten für die spätere Verwendung

Schritt 2: Vorbereitung der Nadeln

Die Nadel ist der Schlüssel zur erfolgreichen Mikroinjektion von C elegans. Der RWD-Mikropipettenzieher hilft bei der Herstellung von 2 Nadeln mit stabiler und gleichmäßiger Leistung. Es wird empfohlen, ein RWD-Kapillarglasröhrchen zum Ziehen der Pipette zu verwenden, um die Spitze der Nadeln schnell mit Stammlösung zu füllen. Auf diese Weise können die Luftblasen entweichen. Im Allgemeinen liegen die Spitzendurchmesser bei bis zu 1μm und die Konuslänge bei etwa 5~7mm.

Schritt 3: DNA-Vorbereitung und Befüllen einer Nadel-Ladepipette

Wählen Sie je nach den experimentellen Anforderungen die Substanzen für die Stammlösung aus. Zum Beispiel DNA, RNA, Proteine und andere Substanzen. Die Reinheit der Stammlösung ist einer der wichtigsten Faktoren, die die Effizienz der Injektion beeinflussen. Verwenden Sie eine kleine und dünne chemische Pipette, um die Stammlösung durch die Spitze der Nadeln in die Pipette zu geben. Beobachten Sie die Spitze nach einigen Minuten, um festzustellen, ob sich Luftblasen gebildet haben

Schritt 4: Brechen

Legen Sie das Deckglas auf die mit der Stammlösung gefüllte Agarplatte. Bewegen Sie den RWD-Mikromanipulator, um die Nadel gegen die Kante des Objektträgers zu stoßen. Wenn die Spitze abgebrochen wird, tritt die Vakuole aus. Diese Methode ermöglicht ein einfaches Eindringen der Nadel in den Wurm

Schritt 5: Montieren der Würmer

Junge gravide Würmer werden üblicherweise für die Mikroinjektion ausgewählt, da ihre Keimdrüsen in diesem Stadium voll entwickelt sind und die Würmer leicht einer DNA-Transfektion unterzogen werden können, was zur Erzeugung von transgenen Nachkommen führt. Setzen Sie den Wurm mit einem Plektrum auf die Agarplatte. Passen Sie die Position so an, dass die Keimdrüse nach außen gerichtet ist. Geben Sie ein paar Tropfen Halocarbonöl hinzu, um den Wurm vollständig zu bedecken.

Schritt 6: Mikroinjektion

Setzen Sie die Agarplatte auf den Kreuztisch. Suchen Sie den Wurm unter dem Mikroskop und fokussieren Sie auf die Keimdrüse, indem Sie die Kondensorlinse einstellen. Verwenden Sie den RWD Mikromanipulator, um die Nadel in die Keimdrüse einzuführen. Schalten Sie die RWD Nanoliter-Mikroinjektionspumpe ein, um mit der Injektion zu beginnen

Schritt 7: Rückgewinnung des Wurms

Geben Sie unter dem Stereomikroskop ein paar Tropfen Pufferlösung auf den injizierten Wurm. Nach 2-5 Minuten wird der Wurm wieder aktiv. Er sollte anfangen zu schwimmen und seinen Kopf von einer Seite zur anderen bewegen. Zu diesem Zeitpunkt können Sie ihn zurück in die Zellkulturplatten überführen, um ihn bei 20℃ zu kultivieren.

Vorsichtsmaßnahmen[2]

Agarplatten: Wenn der Wurm auf der Agarplatte schnell stirbt, ist dies ein Hinweis darauf, dass die Platte zu trocken ist. In diesem Fall kann sie durch eine andere Platte mit einer dünneren Agarschicht ersetzt werden, da die Agarose hauptsächlich dazu dient, Wasser vom Wurm zu absorbieren; wenn der Wurm nicht fest auf der Platte haften kann, ist dies ein Hinweis darauf, dass die Platte zu nass oder zu dünn ist. In diesem Fall ist es ratsam, die Platte für eine gewisse Zeit in den Ofen zu stellen oder den Wurm auf die Platte zu kleben, bevor das Halocarbonöl hinzugefügt wird

Substanzen für die Injektion: Die DNA-Lösung muss vor der Injektion gut gemischt und zentrifugiert werden, damit die Nadelspitze nicht verstopft. Die DNA-Konzentration sollte unter 200 mg/L gehalten werden, da eine hochkonzentrierte DNA-Lösung Toxine produziert und zu einer Überexpression der Gene führt

Ausrichtung der Injektion: Die Nadel und die Keimdrüse sollten in einem spitzen Winkel positioniert werden. Es wird empfohlen, die Nadel waagerecht oder in einem Winkel von 15° zum Kopf oder Schwanz zu platzieren.

Für den Versuch verwendete Probe: Stellen Sie sicher, dass die injizierten Würmer gut gefüttert und gesund sind.

Hohe Sterberate der injizierten Würmer: Wenn die Wiederherstellung der Würmer zu lange oder zu kurz dauert, kann das daran liegen, dass die Nadel zu groß ist oder die injizierte DNA kontaminiert ist. Hier könnte eine dünnere Nadel Abhilfe schaffen. Versuchen Sie auch, nur eine Keimdrüse auf einmal zu injizieren. Wenn die Mikroinjektion ordnungsgemäß durchgeführt wurde, aber keine transgenen Würmer entstehen, kann dies an der durch die genetische Transformation verursachten Letalität liegen oder daran, dass die injizierten Nukleinsäuren verunreinigt sind und erneut gereinigt werden müssen

Referenzen:

[1] Matthias Rieckher und Nektarios Tavernarakis. Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.

[2] Krishna S. Ghanta et al. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.