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Wie bereitet man schnell qualitativ hochwertige Ratten- oder Maus-Nervenzellsuspensionsproben vor?
Neuronen (auch Neuronen oder Nervenzellen genannt) sind die grundlegenden Einheiten des Gehirns und des Nervensystems. Die Isolierung und Kultivierung von Nervenzellen in vitro hat sich als sehr wirkungsvoller Ansatz zur Behandlung des neurobiologisc
Primäre Neuronenkulturen sind leistungsstarke Modellsysteme, die verwendet werden, um Neuronenmorphologie und -differenzierung, Synapsenfunktion und Neurotransmitterfreisetzung, Neurotoxizität während der vorklinischen Arzneimittelentwicklung und Krankheitsmodellierung zu untersuchen. Da sich Neuronen nach der Trennung nicht teilen und wieder vermehren, würde die Etablierung einer einfachen, reproduzierbaren und kostengünstigen Methode zur Isolierung und Kultivierung der primären Nervenzellen die neurowissenschaftliche Forschung erheblich voranbringen.
Primäre Neuronen sind jedoch sehr empfindlich gegenüber Isolationsbedingungen und ihrer Kultur- oder Wachstumsumgebung. Da sich die Methoden von Labor zu Labor unterscheiden, sind Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reifungsraten sehr unterschiedlich und machen es schwierig, Ergebnisse zu vergleichen und Experimente zwischen Labors zu wiederholen.
Wie kann man also schnell qualitativ hochwertige Ratten-/Maus-Nervenzellsuspensionsproben herstellen?
Im Vergleich zu neugeborenen Mäusen ist die Dissoziation des Gehirns erwachsener Ratten komplexer und erfordert eine Kombination aus mechanischer und enzymatischer Hydrolyse, um die extrazelluläre Matrix abzubauen. Typischerweise erfordert die Entfernung des Myelins eine verlängerte Inkubationszeit mit Verdauungsenzymen, eine starke mechanische Desintegration und/oder zusätzliche Schritte zur Myelinreinigung, was insgesamt die Gewinnung und Lebensfähigkeit von primären Zellsuspensionen beeinträchtigt.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von Maus-Neuralzellen mit sanfter Enzymformulierung zur Gewebeverdauung. Die detaillierten experimentellen Instrumente, Materialien und experimentellen Verfahren sind wie folgt aufgelistet.
Experimentelle Instrumente und Materialien
RWD DSC-400 Einzelzellsuspensions-Dissoziator;
RWD HJ-400 Heizmantel;
RWD DHABE-5003 Enzymatisches Verdauungskit für das Gehirn von Erwachsenen mit hoher Aktivität (Maus und Ratte);
RWD SCT-100 Gewebeverarbeitungsröhrchen;
70 μm Zellfilter;
RWD Chirurgisches Instrument für Tiere;
Lieferungen für Zellkulturen; Pipette.
Versuchsdurchführung
Mischen Sie den Enzym-MIX gemäß den Anweisungen und aktivieren Sie ihn mit einem Wasserbad bei 37 ° C.
Das Hirngewebe erwachsener Ratten (P>7) wurde präpariert und vorübergehend in Petrischalen mit HBSS (Ca2+ und Mg2+) gelagert. Die Blutgefäße des Gehirngewebes wurden vorsichtig so weit wie möglich mit einer Pinzette entfernt
Geben Sie das Gehirngewebe und das Enzym MIX in das Gewebeverarbeitungsröhrchen und schneiden Sie das gesamte Gehirn mit einer Schere in 4 Teile.
Invertieren Sie das Gewebebehandlungsrohr zum Einzelzellsuspensionsdissoziator, installieren Sie den Heizmantel und führen Sie das Programm M_ABrain_Heater_2 aus.
Zellsuspensionsproben wurden mit einem Zellfilter filtriert und für 10 min bei 300 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie das Defragmentierungsreagenz hinzu, mischen Sie gut, legen Sie die obere Schicht mit vorgekühltem PBS auf und zentrifugieren Sie bei 3000 × g für 10 min bei 4 ° C mit einer Geschwindigkeit von 5 und einer Geschwindigkeit von 3. Die untere Schicht aus Zellpellets aufbewahren, waschen und sammeln.
7. Rotbetrieb knacken (optional).
8. Zellzählung und Durchflusszytometrie
Die Zellen des Hirngewebes von erwachsenen Mäusen, die von einem RWD-Einzelzellsuspensions-Dissoziatorgerät verarbeitet werden, können eine Zelllebensfähigkeit von 90 % erreichen, was ein idealer Prozentsatz für das nachgeschaltete Experiment ist. Das RWD DHABE-5003 Mouse Adult Brain Tissue Gentle Enzymolysis Kit kann für Einzelzellsuspensions-Dissoziatoren des gesamten Gehirngewebes von erwachsenen Ratten oder Mäusen (P>7) verwendet werden. Es kann auch die Isolierung aller neuralen und nicht-neuronalen Zellen im Gehirn.
