Drei Gründe für den Verzicht auf kontinuierliche Zelllinien

Im Jahr 1665 entdeckte und benannte der britische Wissenschaftler Robert Hooke die Zelle.

Später schlugen die deutschen Biologen Matthias Jakob Schleiden und Theodor Schwann die Zelltheorie vor und vermittelten damit allen ein klareres Verständnis der Zelle, einer relativ unabhängigen Einheit, aus der unser Leben besteht.

Um das Wesen des Lebens besser zu verstehen und die Gesetzmäßigkeiten der Lebensaktivitäten von Zellen aufzudecken, haben Wissenschaftler eine Reihe von Forschungen über die Vermehrung, die Bewegung, den Stoffwechsel, den Tod und andere Aktivitäten von Zellen durchgeführt. Bereits im 19. Jahrhundert schlugen einige Leute vor, lebende Zellen von Geweben zu trennen, aber die Kultur von tierischen Zellen wurde erst 1950 untersucht. Von der einfachen Beobachtung der Zellentwicklung über die Isolierung von Primärzellen aus Gewebe bis hin zur Gewinnung von kontinuierlichen Zelllinien, die ständig weitergegeben werden können. Der Wandel der Zellen von einem illusorischen Konzept zu einem unverzichtbaren Versuchsmaterial für In-vitro-Forschungsexperimente hat die gesamte Geschichte der biologischen Entwicklung durchlaufen. Die für die wissenschaftliche Forschung verwendeten Zellen werden hauptsächlich in zwei Arten unterteilt: direkt aus Gewebe isolierte Primärzellen und gekaufte Zelllinien.

In der Regel werden die Zellen der ersten bis zehnten Passage, die aus dem Gewebe isoliert werden, als Primärzellen bezeichnet, und die meisten Primärzellen werden danach allmählich stagnieren, altern und absterben, und nur eine sehr kleine Anzahl von Zellen kann bis zur fünfzigsten Generation überleben. Nach fünfzig Generationen hat sich die genetische Information der Zellen verändert, und sie sind zu einer kontinuierlichen Zelllinie geworden. Sie hat die Eigenschaften der Unsterblichkeit, und einige Zellen haben die Kontakthemmung verloren, können in mehreren Schichten wachsen und nach allogener Inokulation sogar Tumore verursachen

Kontinuierliche Zelllinien waren aufgrund ihrer Unsterblichkeit und schnellen Teilung stets die erste Wahl für Studien auf Zellebene. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch eine einfache Kultur, eine große Vielfalt, eine schnelle Wachstumsrate, niedrige Kosten und eine schnelle Forschung aus, so dass verschiedene kontinuierliche Zelllinien weit verbreitet sind. Hela-Zellen beispielsweise sind die erste menschliche Zelllinie, die unbegrenzt weitergegeben werden kann. Sie helfen Wissenschaftlern, sich effizienter auf menschliche Zellkrankheiten und den Wirkmechanismus von Medikamenten zu konzentrieren, und werden in der Onkologie, Immunologie, Virologie und anderen Disziplinen weithin eingesetzt.

In den letzten Jahren haben Studien ergeben, dass kontinuierliche Zelllinien zwar voller Schätze sind, dass es aber immer noch einige Einschränkungen bei ihrer Anwendung gibt.

Einschränkung 1: Die Biologie der Zelle wird verändert

Während des Forschungsprozesses wird oft eine große Anzahl von Proben benötigt, so dass eine schnelle Vermehrung und Expansion von kontinuierlichen Zelllinien erforderlich ist. Der kontinuierliche Vermehrungsprozess ist anfällig für Mutationen, und die uneingeschränkte Vermehrung kann zu Veränderungen des Genotyps und des Phänotyps der Zelllinie führen, was die Versuchsergebnisse beeinträchtigt. Gleichzeitig sind die biologischen Eigenschaften von immortalisierten Zelllinien und lebenden Zellen recht unterschiedlich, und sie können die reale Umgebung in Tieren nicht vollständig repräsentieren. Primäre Zellen gelten als repräsentativer für die In-vivo-Gewebesituation und sind in einigen Ländern/Regionen rechtlich anerkannt (Human Tissue Act 2004, UK), insbesondere bei frühen Tests zur Bewertung der Toxizität von Arzneimitteln; im Vergleich zu Zelllinien ist die Verwendung primärer Zellen, die direkt aus Patientengewebe isoliert werden, geeigneter.

Einschränkung 2: Kreuzkontamination von Zelllinien

Wenn es um die Kontamination von Zellen geht, denkt jeder zuerst daran, dass pathogene Mikroorganismen das Scheitern von Zellexperimenten verursachen. Damit ist jedoch nicht gemeint, dass die Bakterienvermehrung im Kultursystem das Experiment beeinträchtigt, sondern die Kreuzkontamination zwischen Zelllinien, d. h. die für das Experiment verwendeten Zelllinien können mit anderen Zelltypen vermischt werden. Dieses Problem kann bei der Erstellung der Zelllinie entstehen oder durch unsachgemäße Eingriffe verursacht werden, z. B. durch die gleichzeitige Kultivierung mehrerer Zellen, die Wiederverwendung von Verbrauchsmaterialien oder durch verwandte Zellkulturprodukte. Jeder unsachgemäße Vorgang kann zum Scheitern des gesamten Experiments führen

Im Jahr 2011 haben die Vereinigten Staaten einen nationalen Standard für die Identifizierung von Zellstämmen herausgegeben. Obwohl sich viele Forscher der Ernsthaftigkeit des Problems noch nicht bewusst sind, haben die einschlägigen Einrichtungen begonnen, Alarm zu schlagen:

Sowohl in der Dezemberausgabe 2014 als auch in der Februarausgabe 2015 der Fachzeitschrift Science wurden Artikel veröffentlicht, in denen die Schwere der Kreuzkontamination und der falschen Identifizierung von Zellen erläutert und die Folgen der Kontamination aufgezeigt wurden. Dadurch werden nicht nur Zeit und Energie verschwendet, sondern auch die Forschungsergebnisse können nicht reproduziert werden, und die Auswirkungen sind sehr ernst. Daher haben maßgebliche Institutionen wie die NIH und ATCC wiederholt dazu aufgerufen, Zellen zu identifizieren. Im April 2015 kündigte Nature an, dass alle Fachzeitschriften von ihren Autoren verlangen würden, die in ihren Arbeiten verwendeten Zelllinien zu identifizieren. Im Juni wurde dann berichtet, dass ein Wissenschaftler den Nature-Artikel aufgrund von Problemen mit den Zelllinien zurückzog. Im Oktober 2017 wurde in der Fachzeitschrift PLoS ONE ein Artikel veröffentlicht, in dem festgestellt wurde, dass es eine Kreuzkontamination der in mehr als 30 000 Arbeiten verwendeten HeLa-Zelllinien gab, wodurch die Forschungsergebnisse ungültig wurden[1]. Eine weitere Studie aus dem Jahr 2019 zeigte, dass mindestens 24 % der menschlichen Zelllinien mit HeLa kontaminiert waren[2].

Einschränkung 3: Anwendung der Zellen

Viele Zellen können sich in vitro nicht vermehren, und für jedes Experiment müssen Primärzellen aus frischem Gewebe isoliert werden. Dazu gehören Neuronen, Skelettmuskelzellen, Kardiomyozyten, Perizyten und terminal differenzierte Hepatozyten usw.

Darüber hinaus kommt der Zustand von Primärzellen der physiologischen Umgebung im Körper am nächsten und kann bestimmte biologische Eigenschaften des Gewebes erhalten. Daher sind sie die beste Wahl für die Bewertung der Wirksamkeit und Virulenz von Arzneimitteln, und gleichzeitig ist die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination deutlich geringer. Darüber hinaus ist für Studien in den Bereichen Onkologie und Immunologie, wenn lebende Tiermodelle beteiligt sind, die Isolierung von Primärzellen erforderlich. Die Kultivierung von Primärzellen ist jedoch sehr viel schwieriger als die von gewöhnlichen Zelllinien. Die Isolierung und Vorbereitung von Primärzellen war schon immer ein dringend zu lösendes Problem. Wie kann man unter der Voraussetzung, dass die Reproduzierbarkeit gewährleistet ist, effizient eine Einzelzellsuspension mit hoher Aktivität herstellen?

Der RWD Single Cell Suspension Dissociator löst dieses Problem auf einfache Weise. Das selbstentwickelte Gewebeverarbeitungsröhrchen, das enzymatische Verdauungskit und die eingebauten Optimierungsprogramme für die Herstellung hochaktiver Einzelzellsuspensionen und Gewebehomogenate.

Das Gerät ermöglicht die schnelle Herstellung von Einzelzellsuspensionen mit hoher Aktivität und guter Homogenität, wodurch die Wiederholbarkeit von Experimenten erhöht wird. Es verfügt über vier unabhängige Kanäle, und der Heizmantel kann die Effizienz der Gewebeverarbeitung verbessern. Es findet breite Anwendung in der Immunologie, Onkologie, Neurobiologie und anderen Forschungsbereichen.

Nach der Gewinnung der einzelnen Zellsuspension müssen die Zellen gezählt und auf ihre Lebensfähigkeit hin analysiert und in ein Kultursystem oder ein entsprechendes Puffersystem gegeben werden. Mit dem automatischen Zellzähler C100 von RWD können Primärzellen genau gezählt werden. Mit mehreren Fluoreszenzkanälen kann er Zellen in Suspension schnell quantitativ analysieren und gleichzeitig Hellfeld- und Fluoreszenzbilder anzeigen, die die Zählergebnisse und die Zellmorphologie deutlich machen. Es eignet sich sehr gut für Immunologie, Impfstoffentwicklung, Zelltherapie, Tumorforschung, Stammzell- und Stoffwechselforschung und andere Bereiche.

Die Zellkultur ist der letzte Schritt im Prozess der primären Zellseparation. Der RWD-CO2-Inkubator kann die Temperatur und die Kohlendioxidkonzentration präzise steuern und eine Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit aufrechterhalten. Der hocheffiziente HEPA-Filter kann die Luftverschmutzung durch Partikel wirksam beseitigen, und die Sterilisation mit trockener Hitze bei 140 °C ermöglicht eine regelmäßige Sterilisation und Wartung des Inkubators und bietet eine stabile und saubere Kulturumgebung für Primärzellproben.

【Referenzen】

1. Serge P. J. M. Horbach， Willem Halffman. The ghosts of HeLa：How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS ONE， Published：October 12， 2017， doi：10.1371/journal.pone.0186281

2. Lin J, Chen L,Jiang W, Zhang H, Shi Y, Cai W. Rapid detection of low-level HeLa cell contamination in cell culture using nested PCR. J Cell Mol Med.2019;23(1):227-236. doi:10.1111/jcmm.13923