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Eine kurze Einführung in die Forschungstechnologie der Molekularbiologie: PCR

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Eine kurze Einführung in die Forschungstechnologie der Molekularbiologie: PCR

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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine weit verbreitete Methode zur schnellen Herstellung von Millionen bis Milliarden von Kopien (vollständig oder teilweise) einer bestimmten DNA-Probe, die es Wissenschaftlern ermöglicht, eine sehr kleine DNA-Probe zu nehmen und sie (oder einen Teil davon) auf eine ausreichende Menge zu vervielfältigen, um sie im Detail zu untersuchen. Die PCR wurde 1983 von dem amerikanischen Biochemiker Kary Mullis bei der Cetus Corporation erfunden; Mullis und der Biochemiker Michael Smith, der andere wichtige Methoden zur Manipulation der DNA entwickelt hatte, wurden 1993 gemeinsam mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.

Die einzelnen Schritte, die den meisten PCR-Methoden gemeinsam sind, lauten wie folgt:

Initialisierung: Dieser Schritt ist nur bei DNA-Polymerasen erforderlich, die eine Wärmeaktivierung durch Hot-Start-PCR erfordern. Er besteht darin, die Reaktionskammer auf eine Temperatur von 94-96 °C (201-205 °F) bzw. 98 °C (208 °F) zu erhitzen, wenn extrem thermostabile Polymerasen verwendet werden, die dann 1-10 Minuten lang gehalten wird.

Denaturierung: Dieser Schritt ist der erste reguläre Zyklus und besteht aus dem Erhitzen der Reaktionskammer auf 94-98 °C (201-208 °F) für 20-30 Sekunden. Dies führt zum Schmelzen oder zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Matrize, indem die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen gebrochen werden, wodurch zwei einzelsträngige DNA-Moleküle entstehen.

Ausglühen: Im nächsten Schritt wird die Reaktionstemperatur für 20-40 Sekunden auf 50-65 °C gesenkt, um das Annealing der Primer an die einzelsträngigen DNA-Moleküle zu ermöglichen. In der Regel werden zwei verschiedene Primer in die Reaktionsmischung gegeben: einer für jedes der beiden einzelsträngigen Komplemente, die die Zielregion enthalten. Die Primer sind selbst einzelsträngige Sequenzen, die jedoch viel kürzer als die Länge der Zielregion sind und nur sehr kurze Sequenzen am 3'-Ende jedes Strangs ergänzen.

Es ist von entscheidender Bedeutung, eine geeignete Temperatur für den Annealing-Schritt zu bestimmen, da Effizienz und Spezifität stark von der Annealing-Temperatur beeinflusst werden. Diese Temperatur muss niedrig genug sein, um die Hybridisierung des Primers an den Strang zu ermöglichen, aber hoch genug, damit die Hybridisierung spezifisch ist, d. h. der Primer sollte nur an einen perfekt komplementären Teil des Strangs binden und nirgendwo anders. Ist die Temperatur zu niedrig, kann der Primer nur unvollständig binden. Ist sie zu hoch, bindet der Primer möglicherweise überhaupt nicht. Eine typische Annealing-Temperatur liegt etwa 3-5 °C unter der Tm der verwendeten Primer. Stabile Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen werden nur dann gebildet, wenn die Primersequenz sehr eng mit der Template-Sequenz übereinstimmt. In diesem Schritt bindet die Polymerase an das Primer-Template-Hybrid und beginnt mit der DNA-Bildung.

Verlängerung/Dehnung: Die Temperatur in diesem Schritt hängt von der verwendeten DNA-Polymerase ab; die optimale Aktivitätstemperatur für die thermostabile DNA-Polymerase der Taq-Polymerase liegt bei etwa 75-80 °C (167-176 °F),[14][15] obwohl für dieses Enzym üblicherweise eine Temperatur von 72 °C (162 °F) verwendet wird. In diesem Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase einen neuen DNA-Strang, der zum DNA-Matrizenstrang komplementär ist, indem sie freie dNTPs aus dem Reaktionsgemisch hinzufügt, die in 5'-zu-3'-Richtung komplementär zur Matrize sind, wobei die 5'-Phosphatgruppe der dNTPs mit der 3'-Hydroxygruppe am Ende des naszierenden (verlängerten) DNA-Strangs kondensiert. Die genaue Zeit, die für die Elongation benötigt wird, hängt sowohl von der verwendeten DNA-Polymerase als auch von der Länge der zu amplifizierenden DNA-Zielregion ab. Als Faustregel gilt, dass die meisten DNA-Polymerasen bei ihrer optimalen Temperatur eintausend Basen pro Minute polymerisieren. Unter optimalen Bedingungen (d. h. wenn es keine Beschränkungen durch limitierende Substrate oder Reagenzien gibt) wird bei jedem Verlängerungs-/Verlängerungsschritt die Anzahl der DNA-Zielsequenzen verdoppelt. Mit jedem aufeinanderfolgenden Zyklus werden die ursprünglichen Template-Stränge plus alle neu erzeugten Stränge zu Template-Strängen für die nächste Verlängerungsrunde, was zu einer exponentiellen (geometrischen) Amplifikation der spezifischen DNA-Zielregion führt.

Die Prozesse der Denaturierung, des Annealings und der Elongation bilden einen einzigen Zyklus. Es sind mehrere Zyklen erforderlich, um die DNA-Zielregion auf Millionen von Kopien zu amplifizieren. Die Formel zur Berechnung der Anzahl der nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen gebildeten DNA-Kopien lautet 2n, wobei n die Anzahl der Zyklen ist. Eine Reaktion mit 30 Zyklen ergibt also 230 bzw. 1.073.741.824 Kopien der ursprünglichen doppelsträngigen DNA-Zielregion.

Abschließende Elongation: Dieser einzelne Schritt ist fakultativ, wird jedoch bei einer Temperatur von 70-74 °C (158-165 °F) (dem Temperaturbereich, der für die optimale Aktivität der meisten in der PCR verwendeten Polymerasen erforderlich ist) für 5-15 Minuten nach dem letzten PCR-Zyklus durchgeführt, um sicherzustellen, dass jede verbleibende einzelsträngige DNA vollständig elongiert ist.

Abschließendes Halten: Der letzte Schritt kühlt die Reaktionskammer für unbestimmte Zeit auf 4-15 °C ab und kann zur kurzfristigen Lagerung der PCR-Produkte verwendet werden.

Warum Gradienten-PCR?

Als Gradienten-PCR-Gerät wird ein Gerät bezeichnet, das eine Reihe unterschiedlicher Annealing-Temperaturen für eine einmalige PCR-Amplifikation einstellen kann. Da verschiedene DNA-Fragmente unterschiedliche optimale Annealing-Temperaturen haben, kann das Gradienten-PCR-Gerät verwendet werden, um eine Reihe von Gradienten-Annealing-Temperaturen für die Amplifikation einzustellen, so dass bei der einmaligen PCR-Amplifikation die optimalen Annealing-Temperaturen mit hoher Expression herausgesucht, die Reaktionsbedingungen optimiert und eine effektive Amplifikation durchgeführt werden kann.

Im Idealfall ist die Annealing-Temperatur niedrig genug, um ein effektives Annealing der Primer mit der Zielsequenz zu gewährleisten, und hoch genug, um unspezifische Bindungen zu reduzieren.

M2-96G PCR-Gradient-Thermocycler

1. 12 Gradiententemperaturen können gleichzeitig eingestellt werden, um eine effiziente und genaue Temperaturkontrolle zu erreichen.

2. Sieben Zoll HD-Touchscreen, intuitive und bequeme Bedienung.

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Es eignet sich für die Molekularbiologie, Mikrobiologie, Genetik, Zellbiologie, Lebensmittelwissenschaft, Agronomie und andere Bereiche, um experimentelle Forschung zum molekularen Klonen, Genexpressionsanalyse, Genotyp-Identifizierung, Sequenzierung, Analyse pathogener Mikroorganismen und so weiter durchzuführen.