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#Neues aus der Industrie
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Superauflösende Bildgebung des Gehirns
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Licht - und alle Wellen - kann sich um die Ecken von Hindernissen auf seinem Weg biegen. Aufgrund dieses Phänomens, das als Beugung bezeichnet wird, ist es unmöglich, Licht auf einen Punkt zu fokussieren, der kleiner als die Hälfte seiner Wellenlänge ist. Mit anderen Worten: Die höchste Auflösung, die man mit einem Lichtmikroskop theoretisch erreichen kann, liegt bei etwa 250 nm, eine Grenze, die man Beugungsgrenze nennt. Leider reicht diese Auflösung nicht aus, um feine zelluläre Strukturen, wie sie z. B. in Neuronen vorkommen, zu beobachten.
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Über mehr als ein Jahrhundert waren Mikroskopiker durch diese klassische Barriere gelähmt, bis zur Erfindung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Ein besonders leistungsfähiger Ansatz wurde in den späten 1990er Jahren entwickelt und als STED-Mikroskopie (stimulated-emission depletion) bezeichnet. Diese Technik setzt voraus, dass die Zielprobe Fluorophore enthält, d. h. Verbindungen, die Licht bei einer Wellenlänge absorbieren und es dann bei einer längeren Wellenlänge wieder emittieren. In der einfachsten Version der STED-Mikroskopie werden Fluorophore in einem kreisförmigen Spot durch Bestrahlung mit einem beugungsbegrenzten fokussierten Laser angeregt. Dann wird ein donutförmiger Bereich um den Spot herum mit weniger energiereichem Licht - dem Depletion Beam - bestrahlt, der die Fluoreszenz durch den Prozess der stimulierten Emission abschaltet. Der Nettoeffekt ist also, dass nur die Fluorophore im Zentrum des Donuts wieder Photonen emittieren, und da dieser Bereich beliebig klein gemacht werden kann, ermöglicht dies die superauflösende Mikroskopie.
Obwohl die STED-Mikroskopie ein echter Durchbruch für die Beobachtung der Morphologie lebender Neuronen bei höherer Auflösung war, gibt es noch Raum für Verbesserungen. In einer kürzlich in Neurophotonics veröffentlichten Studie entwickelte ein Team von Wissenschaftlern unter der Leitung von Dr. U. Valentin Nägerl von der Université de Bordeaux eine einfache, aber effektive Kalibrierungsmethode, die eine präzisere STED-Bildgebung in höheren Gewebetiefen ermöglicht. Ihr Ansatz basiert auf der Analyse und Korrektur einer der Hauptquellen für systematische Fehler in der STED-Mikroskopie für biologische Proben: sphärische Aberration des Verarmungsstrahls.
Bei der Abbildung einer Gewebeprobe in Tiefen von mehr als 40 μm erleidet der Verarmungsstrahl verschiedene Arten von Defokussierung und Degradation (Aberration) und verliert seine sorgfältig ausgearbeitete Form, die für die STED-Methode wesentlich ist. Sphärische Aberration ist der größte Übeltäter und war das Ziel der Forscher. Ihre Strategie bestand darin, zunächst ein Hirngewebe-Phantom zu präparieren, einen auf Gel basierenden Proxy mit einem Brechungsindex, der dem des tatsächlichen Gehirns ähnelt. Diese Phantomprobe enthielt homogen dispergierte Fluorophore und Gold-Nanopartikel, wodurch das Team deutlich visualisieren und quantifizieren konnte, wie die Form des Verarmungsstrahls verzerrt wurde, wenn er tiefer eindrang. Anschließend berechneten sie die notwendigen Voreinstellungen, die am Verarmungsstrahl je nach Gewebetiefe vorgenommen werden sollten, damit seine endgültige Form der idealen Form näher kommt. Die Anpassungen wurden mit Hilfe der adaptiven Optik vorgenommen, einer Technologie, die ursprünglich von Astronomen entwickelt wurde, um Teleskopbilder zu verbessern, die unter den durch die Erdatmosphäre verursachten Aberrationen leiden.
Nachdem die Form des Verarmungsstrahls anhand der Phantomtests kalibriert worden war, gingen die Wissenschaftler dazu über, lebendes neuronales Gewebe abzubilden. Sie verglichen die Ergebnisse der regulären STED-Mikroskopie, der korrigierten STED-Mikroskopie und der Zwei-Photonen-Mikroskopie - einer Technik, die speziell für die Abbildung von tiefem Gewebe angepasst ist. Die Ergebnisse waren ziemlich überzeugend: Korrigierte STED-Bilder erfassten die feinen Details der tieferen neuronalen Dendriten viel besser als Standard-STED-Bilder. "Mit unserer Kalibrierungsstrategie konnten wir neuronale Strukturen bis zu einer Größe von 80 nm in einer Tiefe von 90 μm in biologischem Gewebe messen und nach der Korrektur der sphärischen Aberration eine 60-prozentige Signalsteigerung erzielen", sagt Nägerl.
Ji Yi, Professor für biomedizinische Technik an der Johns Hopkins University, bemerkt: "Die superauflösende Mikroskopie wurde bisher vor allem für dünne Proben, wie z. B. einschichtige Zellen, angewendet, bei denen die Lichtstreuung vernachlässigbar ist. Das Team unter der Leitung von Valentin Nägerl implementierte adaptive Optik in eine Zwei-Photonen-stimulierte Emissionsverarmungsmikroskopie (2P-STED) und erreichte eine Auflösung von 80 nm bei der Abbildung von Neuronen-Dendritenstacheln durch 90 Mikrometer großes Hirngewebe. Dies ist bemerkenswert, da eine Superauflösung in dickerem Gewebe schwer aufrechtzuerhalten ist - insbesondere angesichts der hohen Streuung von Hirngewebe." Yi erklärt, dass der Fortschritt die Untersuchung neuronaler Aktivitäten und Interaktionen erleichtern wird.
Da dieser neuartige Kalibrierungsprozess robust, einfach zu implementieren und relativ kostengünstig ist, könnte er leicht in die Standard-Laborpraxis integriert werden, um bessere Ergebnisse mit STED-Mikroskopen zu erzielen, solange die vorbereitete Phantomprobe den optischen Eigenschaften des biologischen Präparats entspricht. Nägerl erklärt hierzu: "Unser Ansatz ist nicht auf Gehirnproben beschränkt; er könnte an andere Gewebe mit bekannten und relativ homogenen Brechungsindizes sowie an andere Arten von Präparaten angepasst werden, möglicherweise sogar an das intakte, lebende Mäusegehirn."