SARS-CoV-2 RapidPlex: Eine Graphen-basierte Multiplex-Telemedizin-Plattform für schnelle und kostengünstige COVID-19-Diagnose und Überwachung by California Institute of TechnologyMedicalExpo

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Er weist das virale Antigen Nukleokapsid-Protein, IgM- und IgG-Antikörper sowie das entzündungsreaktive C-reaktive Protein des Biomarkers auf der Grundlage unserer massenproduzierbaren lasergravierten Graphenelektroden nach. Wir demonstrieren einen ultrasensitiven, hochselektiven und schnellen elektrochemischen Nachweis in den physiologisch relevanten Bereichen. Wir haben die Anwendbarkeit unserer SARS-CoV-2 RapidPlex-Plattform mit COVID-19-positiven und COVID-19-negativen Blut- und Speichelproben erfolgreich evaluiert. Auf der Grundlage dieser Pilotstudie könnte unsere Multiplex-Immunsensor-Plattform Hochfrequenztests zu Hause für die telemedizinische Diagnose und Überwachung von COVID-19 ermöglichen.

Am 11. März 2020 bezeichnete die Weltgesundheitsorganisation den Ausbruch von COVID-19 als Pandemie. Sechs Monate später hatte sich die globale Gesundheitskrise mit über 30 Millionen bestätigten Fällen des neuartigen Coronavirus weltweit fortgesetzt, davon über 22% in den Vereinigten Staaten.1 Es wird geschätzt, dass 14%-20% der Patienten eine schwere Krankheit entwickeln werden, die einen Krankenhausaufenthalt erforderlich macht.2 Anfängliche Bemühungen, die Ausbreitung durch staatlich angeordnete "stay at home"-Verordnungen einzudämmen, schienen wirksam zu sein; die Wiedereröffnung der US-Wirtschaft führte jedoch, wie vorhergesagt, zu einer erneuten exponentiellen Ausbreitung des neuartigen Coronavirus.3 Es wird geschätzt, dass das Bruttoinlandsprodukt der Vereinigten Staaten während einer grippeähnlichen Pandemie ohne verfügbare Impfstoffe Verluste in Höhe von über 45,3 Milliarden US-Dollar erleiden wird.4 Die sichere Wiedereröffnung der Wirtschaft, Schulen und Universitäten erfordert mehrere Ansätze zur Minderung der mit COVID-19 verbundenen Risiken, darunter einfache, erschwingliche und wirksame Test- und Rückverfolgungsmaßnahmen.

Die Eindämmung der Ausbreitung ist schwierig, da es schwierig ist, infektiöse Personen zu identifizieren. Der größte Teil der Ausbreitung von COVID-19 kann ohne Symptome erfolgen. Der Höhepunkt der Virämie kann am Ende der Inkubationszeit liegen, so dass 1-2 Tage vor Symptombeginn eine ausreichende Viruslast übertragen werden kann.3 Aufgrund der unbekannten Dauer und Prävalenz asymptomatischer Fälle kann die wahre Reproduktionszahl unterschätzt werden.5 , 6 Die gemeldete Inzidenz asymptomatischer Patienten reicht von 17,9% bis 30,8%.7 , 8

Der erleichterte Zugang zu COVID-19-Tests hat eine verstärkte Überwachung der Ausbreitung in der Gemeinde ermöglicht, doch einige diagnostische Herausforderungen bleiben bestehen. Gegenwärtig ist die Standardtestmethode die virale Nukleinsäure-Echtzeit-PCR (RT-PCR), die ein langsamer Prozess9 ist und teure Ausrüstung und geschulte Techniker für die Entnahme und Analyse von Nasen-Rachen-Abstrichproben erfordert.9 Darüber hinaus überwältigt das schiere Volumen der erforderlichen Tests die Gesundheitssysteme in ihrer Fähigkeit, den Patienten RT-PCR-Ergebnisse mitzuteilen, was in einigen Staaten zu Verzögerungen von ∼7-10 Tagen führt, um positive10 Befunde mitzuteilen und Isolations- und Überwachungsprotokolle zu erlassen. Trotz der jüngsten Fortschritte bei RT-PCR-Schnelltests am Point-of-Care (POC)11, 12, 13, 14, 15 sind Nukleinsäuretests auch dafür bekannt, dass sie falsch-negative Ergebnisse liefern, was Eindämmungsstrategien und den Zugang zur Behandlung einschränken kann.16 Ein weiterer Vorteil der RT-PCR ist, dass sie nur aktive Träger des Virus identifiziert. Die Identifizierung von Rekonvaleszenten auf der Grundlage der Präsentation von COVID-19-Antikörpern ist ebenso wichtig, da sie den Gesundheitsbehörden entscheidende Informationen über die möglichen Auswirkungen von Wiedereröffnungsmaßnahmen liefern kann.17 Serologische Tests weisen zirkulierende Antikörper nach, die spezifisch für SARS-CoV-2-Antigene sind, einschließlich des Nukleokapsidproteins und des äußeren Spike-Proteins.9 , 18 Es ist jedoch nicht möglich, mittels Antikörpernachweis zwischen asymptomatischen Trägern und immunen Personen zu unterscheiden. Um die Risiken der Ausbreitung von COVID-19 in der Gemeinschaft wirksam zu mindern, sind daher Systeme erforderlich, die gleichzeitig sowohl den viralen als auch den serologischen Status eines Individuums bestimmen. Darüber hinaus zeigen neuere Studien eine Korrelation zwischen der Konzentration zirkulierender entzündlicher Biomarker und dem Schweregrad von COVID-19.19 Bei Patienten, bei denen eine COVID-19-Pneumonie diagnostiziert wurde, wird eine erhöhte Konzentration C-reaktiver Proteine (CRP) festgestellt, die mit zunehmendem Schweregrad assoziiert ist, was auf eine Rolle bei der Diagnose und Prognose von COVID-19-Patienten hindeutet.20 , 21

Es besteht ein klarer und dringender Bedarf an einem hochempfindlichen, schnellen, kostengünstigen, telemedizinischen COVID-19-Test, der den vergangenen und gegenwärtigen Infektionsstatus eines Patienten identifizieren kann.22 Es gab Fortschritte bei der Entwicklung des POC COVID-19-Tests, aber alle kommerziell erhältlichen Testkits liefern nur qualitative Ergebnisse. Die quantitative Analyse von COVID-19-Biomarkern unter Verwendung eines telemedizinischen Geräts kann prädiktive Informationen über den Schweregrad der Erkrankung und Serokonversionsinformationen über den zeitlichen Verlauf der Erkrankung liefern. Elektrochemische Biosensoren sind in dieser Hinsicht aufgrund ihrer schnellen Detektionseffizienz und einfachen Handhabung für POC-Anwendungen vorteilhaft.23, 24, 25, 26, 27 Die einfache, sichere und effektive Probensammlung von COVID-19 hat sich angesichts der aktuellen Testanforderungen als eine Herausforderung erwiesen. Speichel-kompatible POC-Tests wären von Vorteil, da Speichel reichhaltige Informationen enthält und von den Patienten selbst einfach und nicht-invasiv für telemedizinische Tests gesammelt werden kann.28

Hier stellen wir eine neuartige, multiplexte, tragbare, drahtlose elektrochemische Plattform für den ultraschnellen Nachweis von COVID-19 vor: SARS-CoV-2 RapidPlex (Abbildung 1 ). Diese Plattform weist Biomarker, die spezifisch für COVID-19 sind, sowohl im Blut als auch im Speichel quantitativ nach, darunter das Nukleokapsidprotein (NP) von SARS-CoV-2, spezifische Immunglobuline (Igs) gegen das Spike-Protein (S1) von SARS-CoV-2 (S1-IgM und S1-IgG) und CRP, innerhalb physiologisch relevanter Bereiche. Die Plattform verwendet Fängerantigene und Antikörper, die auf massenproduzierbaren, kostengünstigen, lasergravierten Graphen (LEG)29 , 30 Elektroden immobilisiert sind. Diese Multiplex-Plattform verfolgt den Infektionsverlauf durch Diagnose des Krankheitsstadiums und ermöglicht die eindeutige Identifizierung von infektiösen, gefährdeten und/oder immunen Personen (Tabelle 1 ). Die Hauptmerkmale von SARS-CoV-2 RapidPlex sind hohe Sensitivität, geringe Kosten, ultraschnelle Erkennung, drahtlose Fernerkundung und Multiplex-Sensorik, die Informationen zu drei Schlüsselaspekten der COVID-19-Krankheit liefert: Virusinfektion (NP),31 Immunantwort (IgG und IgM),9 und Schwere der Krankheit (CRP).19, 20, 21

Wie in Abbildung 1A dargestellt, besteht SARS-CoV-2 RapidPlex aus vier Graphen-Arbeitselektroden (WEs), einer Ag/AgCl-Referenzelektrode (RE) und einer Graphen-Gegenelektrode (CE), die alle mittels CO2-Lasergravur, einer schnellen, durchsatzstarken und kostengünstigen Produktionsmethode, auf einem Polyimid (PI)-Substrat strukturiert sind (Abbildungen 1B und 1C). Unsere Gruppe hat vor kurzem die Verwendung einer mesoporösen Graphenstruktur demonstriert, die durch Lasergravur für eine hochleistungsfähige und kostengünstige Biosensorik hergestellt wird.29 , 30 Die Materialkosten für die unmodifizierte RapidPlex-Plattform liegen innerhalb von 0,05 Dollar; zusätzliche Kosten für Chemikalien und Reagenzien für die Multiplex-Sensorpräparation liegen je nach Auftragsgröße auf dem Niveau von Dollar. Die Detektion ausgewählter Zielproteine (NP und CRP) und spezifischer Immunglobuline (S1-IgG und S1-IgM) wird durch Sandwich- bzw. indirekte Immunosensing-Strategien auf den LEG-Elektroden erreicht. Die überlegenen Eigenschaften von Graphen in Bezug auf hohe Ladungsmobilität und Oberfläche zusammen mit der hohen Empfindlichkeit und Selektivität der Abtaststrategien, die sowohl Fänger- als auch Detektorrezeptoren einschließen, machen unser Gerät (Abbildung 1D) zu einem äußerst praktischen Werkzeug für den schnellen, genauen und stadienspezifischen Nachweis von COVID-19-Infektionen im Blut sowie in nicht-invasiven Proben von Bioflüssigkeiten, wie z.B. Speichel.

Die Funktionalisierungs- und Modifikationsschritte, die auf den LEG-Oberflächen für die kovalente Anlagerung jedes der spezifischen Rezeptoren durchgeführt werden, die für die Entwicklung unserer SARS-CoV-2 RapidPlex-Plattform erforderlich sind, sind in Abbildung 2 A schematisch dargestellt. 1-Pyrenbuttersäure (PBA) wird als Linker verwendet, um die erforderlichen Rezeptoren in der Graphenschicht zu verankern. Obwohl die Anheftung von funktionellen Gruppen direkt auf der sp2-Kohlenstoffatom-Oberfläche eine der üblichen Methoden zur Funktionalisierung von Graphen ist, sind diese Methoden mit der Forderung nach Defekten oder Kanten im Sensormaterial verbunden, die dessen spezifische physikalische Eigenschaften verändern könnten.32 Im Gegensatz dazu wird hier die Einführung funktioneller Gruppen auf der Sensorschicht mittels Pyrenderivaten bevorzugt, da sie die Konjugation der Graphenschichten nicht stört und ihre Stabilität verbessert.34 , 35 PBA, bestehend aus einer Pyrengruppe, die π-Elektronen enthält, und einer Carboxylgruppe, wird zur Funktionalisierung von Graphenschichten über π-Stapelung und hydrophobe Wechselwirkungen verwendet. Die Pyreneinheiten von PBA interagieren stark mit Graphenschichten, so dass die ursprüngliche Struktur und die Eigenschaften des Graphens gut erhalten bleiben. Die in jedem PBA-Molekül enthaltenen funktionellen Einheiten ermöglichen die Herstellung der affinitätsbasierten Biosensor-Plattform durch die kovalente Kopplung zwischen den Carboxylgruppen auf den PBA-Einheiten und den -NH2-Gruppen der jeweiligen Fängerrezeptoren (spezifische Antikörper oder Fängerproteine). Die Blockierung von nicht reagierten Stellen mit Rinderserumalbumin (BSA) behindert die unspezifische Adsorption anderer Moleküle, die an jeder Assay-Konfiguration beteiligt sind oder in der interessierenden Probe zirkulieren.

Zur elektrochemischen Charakterisierung und zum Nachweis der schrittweisen Selbstassemblierung in beiden Assay-Konfigurationen für den Nachweis ausgewählter Zielmoleküle werden Techniken der differentiellen Pulsvoltammetrie (DPV) und der potenzial-offenen elektrochemischen Impedanzspektroskopie (OCP-EIS) eingesetzt. Die DPV-Messwerte spiegeln die niedrigere Spitzenstromintensität nach jedem Modifizierungsschritt im Zusammenhang mit dem S1-Ig-Assay wider, was auf die behinderte Diffusion der Redox-Markierung zur Elektrodenoberfläche zurückzuführen ist, die sowohl von den Carboxylgruppen als auch von den daran gebundenen Proteinen und biologischen Makromolekülen herrührt (Abbildung 2B). Gleichzeitig wird der Widerstand in den Nyquist-Plots von OCP-EIS nach jedem Funktionalisierungsschritt erhöht (Abbildung 2C). Die erfolgreiche Verankerung von PBA wurde auch mit Rasterelektronenmikroskopie (REM) verifiziert (Abbildung S1). Die elektrochemische Charakterisierung der auf dem Sandwich-Assay basierenden Sensormodifikation unter Verwendung von CRP als Modellmolekül und der oben genannten Techniken ist in Abbildung S2 dargestellt.

Um die native Struktur und die Eigenschaften der gebundenen Biomoleküle zu erhalten, wählten wir PBA als heterobifunktionellen Linker, der die direkte Interaktion zwischen großen Biomolekülen und der Graphenoberfläche wirksam verhindert.33 Um diese Auswahl zu verifizieren, konstruierten wir CRP- und SARS-CoV-2-spezifische IgG-Assaykonfigurationen auf Graphenelektroden, die mit PBA und einem anderen gebräuchlichen Linker, 1H-Pyrrol-1-Propionsäure (PPA), funktionalisiert wurden.30 Bei beiden Assays, bei denen PBA als Linkerträger verwendet wurde (Abbildung 2D), wurden höhere Signal-zu-Blink-(S/B)-Verhältnisse beobachtet, was hauptsächlich auf einen signifikanten Rückgang der Signale zurückzuführen ist, die in Abwesenheit des entsprechenden Zielmoleküls erhalten wurden, wenn PBA anstelle von PPA verwendet wurde. Zusammen mit einer optimalen Blockierungsstrategie kann PBA für die Immobilisierung spezifischer biomolekularer Sonden (z.B. Antikörper, Proteine) verwendet werden, wobei unspezifische Adsorptionen im Rahmen von Immunoassays vermieden werden.36

Die Orientierung von modifizierten antigenen Proteinen auf festen Oberflächen ist stark mit ihrer Aktivität und Reaktivität assoziiert. Spezifische Anti-His-Antikörper können zur Orientierung der Immobilisierung von antigenen Rezeptoren, die Histidinreste enthalten, verwendet werden, aber dies bedeutet einen zusätzlichen Schritt im Vergleich zu ihrer direkten Anheftung auf der Sensorschicht, wie in Abbildung S3A schematisch dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen keine signifikanten Unterschiede in der Assay-Leistung für den IgG-Nachweis auf PBA-Graphenelektroden, die kovalent mit dem spezifischen Beschichtungsprotein (direkte Immobilisierung) und mit Anti-His-Antikörpern für die vorherige Erfassung des Polyhistidin-spezifischen Beschichtungsproteins (orientierte Immobilisierung) funktionalisiert wurden (Abbildung S3B), was beweist, dass die zufällige Proteinorientierung die Zugänglichkeit des Epitops für eine effektive Erkennung durch spezifische Zielantikörper nicht beeinträchtigt. Dies steht in Übereinstimmung mit anderen Berichten, die bestätigen, dass His-markierte Fusionsantigene direkt auf verschiedenen Oberflächen mit Proteinorientierungen immobilisiert werden können, die vollständig mit der Antikörpererkennung kompatibel sind.37, 38, 39, 40 Um den Assay zu vereinfachen und die Kosten und den Zeitaufwand zu reduzieren, haben wir die direkte Immobilisierung des S1-Proteins für den spezifischen Ig-Nachweis durchgeführt.

In Anbetracht der Tatsache, dass eine schnelle Zielbindung für die erfolgreiche Implementierung unserer vorgeschlagenen Plattform als POC-System von wesentlicher Bedeutung ist, untersuchten wir, wie die Ziel- (oder Proben-) Inkubationszeit die Reaktion jedes Biosensors unserer SARS-CoV-2 RapidPlex-Plattform beeinflusst. Abbildung 2E fasst die amperometrischen Signale zusammen, die für jede der vier Sensoreinheiten bei unterschiedlichen Inkubationszeiten (1, 5 und 10 Minuten) in Abwesenheit (Leerwert, B) und Anwesenheit (S) von 500 pg mL-1, 250 ng mL-1 und 50 ng mL-1 von NP-, SARS-CoV-2-spezifischen IgG- und IgM-Isotypen bzw. CRP erhalten wurden. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl für die meisten der hier vorgestellten Studien eine 10-minütige Inkubationszeit gewählt wurde, um die höchste Sensitivität für die Bestimmung ultra-niedriger Konzentrationen jedes Zielmoleküls zu gewährleisten, mit nur 1-minütiger Inkubationszeit ein signifikanter Unterschied zwischen dem Fehlen und dem Vorhandensein jedes der entsprechenden Ziele erreicht wird. Dies ist einer der Hauptvorteile unseres SARS-CoV-2 RapidPlex-Systems als schnelles POC-Gerät zur Überwachung von SARS-CoV-2-Infektionen mit der erforderlichen Empfindlichkeit sowohl für die Protein- als auch für die Ig-Bestimmung. ELISA,17 , 41, 42, 43, 44 Nukleinsäure-Amplifikation,45, 46, 47, 48, 49 Massenspektrometrie,50 oder sogar Kombinationen51 wurden in letzter Zeit u.a. zur Bestimmung der vorgeschlagenen SARS-CoV-2-spezifischen Zielmoleküle berichtet. Die meisten dieser Methoden weisen jedoch entscheidende Fallstricke auf, vor allem in Bezug auf die Probenvorbereitung, die Komplexität und die teuren und sperrigen Ausrüstungsanforderungen, so dass sie als POC-Systeme immer noch sehr schwierig zu implementieren sind. Unser Gerät stellt eine attraktive Alternative zu Standard-Assays für die Proteinbestimmung, wie z.B. ELISA, dar, da es Multiplexing-Fähigkeiten, Remote-Funktionalität und eine kurze Probe-zu-Antwortzeit bietet.

Die Leistung jedes im SARS-CoV-2 RapidPlex enthaltenen Biosensors wurde in phosphatgepufferten Kochsalzlösungen (PBS), die mit 1,0 % BSA ergänzt wurden, durch Messung der amperometrischen Anzeige in Gegenwart erhöhter Konzentrationen von NP, S1-IgG, S1-IgM und CRP charakterisiert (Abbildung 3 ). Die ausgewählten Strategien für das virale NP-Antigen und die CRP-Proteine basieren auf Doppel-Sandwich- bzw. Sandwich-Konfigurationen, wie in Abbildung 3A dargestellt. Die Sandwich-Immunoassays zum Antigennachweis sind im Allgemeinen aufgrund der Beteiligung von zwei verschiedenen Antikörpern als Fänger- und Detektorentitäten hochempfindlich. Angesichts der niedrigen Werte, die für NP und CRP in verdünntem Serum und Speichel (pg mL-1 bis ng mL-1) erreicht werden müssen, halten wir diese Strategien für am besten geeignet, um auf unserer Plattform implementiert zu werden. Die Variation der kathodischen Ströme mit der Konzentration für NP und CRP in gepufferten Lösungen ist in den Abbildungen 3B bzw. 3C dargestellt. S1-IgG und S1-IgM wurden auf der Grundlage indirekter Immunoassays (Abbildung 3D) nachgewiesen, die als sehr geeignet für den Nachweis zirkulierender Makromoleküle in Antiseren und anderen Bioflüssigkeiten angesehen werden. Die Abbildungen 3E und 3F zeigen die Kalibrierkurven für die S1-spezifische Ig-Bestimmung (S1-IgG bzw. S1-IgM) in gepufferten Lösungen. Die Reproduzierbarkeit wurde durch die Werte der relativen Standardabweichung (RSD) nachgewiesen, die mit verschiedenen Biosensoren, die an verschiedenen Tagen auf die gleiche Weise hergestellt wurden, erhalten wurden. RSD-Werte von 6,3 %, 8,4 %, 6,0 % und 7,6 % für 20 ng mL-1 CRP, 250 ng mL-1 S1-IgG, 250 ng mL-1 S1-IgM und 500 pg mL-1 NP-Antigen (n = 5) zeigen eine gute Reproduzierbarkeit sowohl bei der Gerätepräparation als auch bei der Signalübertragung. Darüber hinaus zeigten die Sensoren über eine 5-tägige Lagerzeit bei 4°C stabile Reaktionen (Abbildung S4). Wir beobachteten keine signifikanten Steigungsabweichungen zwischen den Daten, die in richtig verdünntem Humanserum und in gepufferten Lösungen für die Bestimmung jedes Zielanalyten erhalten wurden (z.B. ist der Steigungsempfindlichkeitswert [16,28 nA mL ng-1], der für CRP als Modellanalyt in PBS-gepufferten Lösungen erhalten wurde, fast derselbe wie in verdünnten Serumproben eines gesunden Probanden [16.64 nA mL ng-1]); daher kann eine genaue Quantifizierung der vorgeschlagenen Zielanalyten durch eine einfache Interpolation der kathodischen Messwerte durchgeführt werden, die für jede getestete Probe in der entsprechenden, in gepufferter Lösung erstellten Kalibrierkurve erhalten werden.

Da die diagnostische Sensitivität und Spezifität von Seroprävalenzstudien durch die Verwendung einer Mischung von antigenen Proteinen anstelle eines einzelnen Proteins verbessert werden kann,52 , 53 modifizierten wir Graphen mit einer Mischung von SARS-CoV-2-verwandten Antigenen, NP und S1, um spezifische Immunglobulin-Isotypen gegen beide Antigene im selben WE zu erfassen. Eine Kalibrierungskurve für den (NP + S1)-IgG-Nachweis ist in Abbildung S5 dargestellt. Somit kann diese Methodik für den Nachweis von isotyp-spezifischem IgG (oder IgM) oder einer Kombination beider Ig-Isotypen auf derselben Sensorfläche maßgeschneidert werden, um die Gesamt-Ig-Konzentration besser zu erfassen und somit die Assaysensitivität in der gesamten Patientenpopulation zu erhöhen.

Menschliche Biofluide enthalten eine komplexe und variable Mischung von zirkulierenden Molekülen, die die molekulare Wahrnehmung stören könnten. Darüber hinaus ist ein vernachlässigbares Übersprechen zwischen verschiedenen Arbeitsflächen eine wesentliche Voraussetzung für die genaue und sinnvolle Durchführung von Multiplex-Detektionsmessungen. Daher wurden Selektivität und Crosstalk der SARS-CoV-2 RapidPlex-Plattform evaluiert. Amperometrische Messwerte, die für jeden entwickelten Biosensor gegen Nicht-Zielmoleküle erhalten wurden, sind in Abbildung 4 A dargestellt. Wir evaluierten die spezifische Bindung für SARS-CoV-2-Biomarker im Vergleich zu Biomarkern ähnlicher Coronaviren, einschließlich SARS-CoV und MERS-CoV. Wir beobachteten keine signifikante Kreuzreaktion für NP-, S1-IgG-, S1-IgM- und CRP-Assays in Gegenwart jedes getesteten Interferenten, einschließlich SARS-CoV-2 S1, SARS-CoV S1 und CRP (für NP-Assay), SARS-CoV-2 NP-IgG, SARS-CoV IgG, MERS-CoV IgG, S1-IgG und Negativkontrollen, die Mischungen von IgG und IgM sowohl gegen MERS-CoV als auch SARS-CoV (für S1-IgG- und S1-IgM-Assays) und natriuretisches Peptid vom B-Typ (BNP), NP, SARS-CoV NP und SARS-CoV S1 (für CRP-Assay) enthalten. Das virale SARS-CoV NP-Antigen-Interferent lieferte jedoch einen kathodischen Strom, der ∼80% des Rohstroms entsprach, der für den Nachweis des spezifischen NP-Antigens erhalten wurde. Die Spike-, Hüll- und Membranproteine von SARS-CoV-2 weisen eine Sequenzidentität von 76%-95% mit denen von SARS-CoV auf. Diese prozentuale Homologie ist bei MERS-CoV auf 30%-40% reduziert. Da SARS-CoV-2 NP zu 90 % identisch mit SARS-CoV NP ist,17 , 54, 55, 56 war die beobachtete Interferenz durch das SARS-CoV NP-Antigen zu erwarten. Die mangelnde Selektivität in diesem speziellen Fall ist jedoch nicht besonders besorgniserregend, da in letzter Zeit keine neuen SARS-CoV-Fälle entdeckt wurden; daher kann daraus geschlossen werden, dass diese Interferenz keine Barriere für die selektive Bestimmung von SARS-CoV-2 NP in realen Proben darstellt. Wir haben die amperometrisch abgeleiteten Konzentrationen mit von der Absorption abgeleiteten Konzentrationen, die mittels ELISA gesammelt wurden, weiter ausgewertet. Wie in Abbildung 4B dargestellt, waren die Ergebnisse unseres funktionalisierten elektrochemischen Biosensors linear korreliert (r = 0,955) mit den Ergebnissen unter Verwendung der gleichen Reagenzien in einem herkömmlichen ELISA-Protokoll.

Nachdem die Leistung und Selektivität jedes konstruierten Biosensors einzeln und erschöpfend bewertet wurde, demonstrieren wir die Multiplexing-Fähigkeiten unseres Graphen-Array-Geräts mit vier Arbeitselektroden (4WEs), das mit einem Ag/AgCl RE und einem Graphen CE entwickelt wurde. Das Blockdiagramm mit den Funktionseinheiten, die das integrierte elektronische System bilden, ist in den Abbildungen 4C und 4D dargestellt. Die amperometrischen Messwerte der vier Kanäle werden gleichzeitig erfasst und die Daten werden drahtlos über Bluetooth an ein Benutzergerät übertragen. Das elektronische System, einschließlich der Leiterplatte (PCB) und einer Lithium-Ionen-Polymerbatterie, hat eine Abmessung von 20 × 35 × 7,3 mm. Das kompakte Gerät kann amperometrische Messungen kontinuierlich über 5 h mit einer einzigen Ladung durchführen.

Mit dem Ziel, den Nutzen unseres SARS-CoV-2 RapidPlex-Arrays für die multiplexe und simultane Quantifizierung ausgewählter Zielmoleküle zu demonstrieren, haben wir die potenzielle Kreuzreaktion bewertet, die sich aus der Diffusion von Signalsubstanzen zwischen benachbarten Immunoberflächen ergibt. Zu diesem Zweck wurde jede der vier bequem funktionalisierten Arbeitsflächen mit gepufferten Lösungen inkubiert, die eine signifikant hohe Konzentration jedes der ausgewählten Targets enthielten, gefolgt von den jeweils entsprechenden Detektorrezeptoren. Die Abwesenheit von Crosstalk zwischen den benachbarten WEs wird anhand der experimentellen Messwerte in gepufferten Lösungen überprüft, die 1,0 ng mL-1 NP-Antigen (I), 250 ng mL-1 S1-spezifisches IgG (II) und IgM (III) sowie 50 ng mL-1 CRP (IV) enthalten (Abbildung 4E). Wie vorgesehen, wurde ein signifikant höheres Signal erhalten, wenn jedes Ziel spezifisch erfasst und durch seinen Tracer-Antikörper in der entsprechenden funktionalisierten Immunoberfläche weiter markiert wurde. Diese Ergebnisse zeigen in Verbindung mit denen aus Abbildung 4A die Machbarkeit der entwickelten SARS-CoV-2 RapidPlex-Plattform für die schnelle, selektive und zuverlässige Bestimmung der NP-, S1-IgG- und S1-IgM-Isotypen sowie des CRP in einem einzigen Experiment. Es sei darauf hingewiesen, dass, da IgG und IgM ähnliche Bindungsmechanismen wie virale Antigene aufweisen und die individuelle Quantifizierung von Immunglobulinen kein Mischen der spezifischen Detektormarkierungen erfordert, während der Modifizierung und Markierung einzelne Tröpfchen auf IgG- und IgM-Sensorelektroden verwendet wurden.

Um den Nutzen unseres Geräts in einem komplexeren und realistischeren Szenario nachzuweisen, haben wir die Multiplex-Fähigkeiten von SARS-CoV-2 RapidPlex in repräsentativen Serumproben von COVID-19 RT-PCR-negativen und -positiven Probanden evaluiert. Sensordaten aus den Serumproben eines RT-PCR-negativen Probanden (Abbildung 5 A) und eines RT-PCR-positiven Patienten (Abbildung 5B) zeigen minimales Übersprechen in einer realen und komplexen Probenmatrix, was auf die effiziente Funktionalität von SARS-CoV-2 RapidPlex zur gleichzeitigen Differenzierung der überexprimierten Präsenz von SARS-CoV-2-bezogenen Zielreportern in COVID-19-positiven Proben hinweist. Darüber hinaus ist das SARS-CoV-2 RapidPlex-Gerät in der Lage, signifikante positive Werte für alle Ziele zu liefern, nachdem die COVID-19-positive Serumprobe nur 1 Minute lang inkubiert wurde (Abbildungen 5C und S6): Das anhaltend hohe Signal in positiven Patientenproben zeigt das große Potenzial für die zukünftige Umsetzung des SARS-CoV-2 RapidPlex-Gerätes als ultraschnelles POC-Ferndiagnosetool.

Um die NP-, S1-IgG-, S1-IgM- und CRP-Reaktion auf eine SARS-CoV-2-Infektion mit unseren LEG-basierten Biosensoren weiter zu untersuchen, haben wir jedes Zielmolekül in Serum- und Speichelproben von RT-PCR-bestätigten COVID-19-positiven und -negativen Probanden gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden als Verhältnis zwischen den amperometrischen Messwerten für jede getestete Probe (S) und der jeweiligen Blindprobe (B) aufgetragen, um die Zielerkennung in verschiedenen Konzentrationsbereichen zu vergleichen. Unter Verwendung der Graphensensoren wurden insgesamt 17 COVID-19 RT-PCR-geprüfte Serumproben (10 positiv, 7 negativ) untersucht und insgesamt 8 COVID-19 RT-PCR-geprüfte Speichelproben (5 positiv, 3 negativ) analysiert (Tabelle S1).

Die Ergebnisse aus den Abbildungen 5D und 5E bestätigen, dass RT-PCR-positive COVID-19-Patienten im Vergleich zu RT-PCR-negativen Probanden erwartungsgemäß sowohl in Serum- als auch in Speichelproben signifikant erhöhte Werte der ausgewählten Targets aufweisen, mit medianen S/B-Verhältnissen von 10,53, 11,62, 10,67 und 12,39 im Serum und 2,81, 3,24, 1,62 und 1,76 im Speichel für NP, S1-IgG, S1-IgM bzw. CRP. Wir beobachteten eine Konzentration von NP im Bereich von 0,1-0,8 μg mL-1 und 0,5-2,0 ng mL-1 im Serum bzw. Speichel von COVID-19 Patienten; S1-IgG im Bereich von 20-40 μg mL-1 und 0,2-0.5 μg mL-1 im COVID-19-Patientenserum bzw. im Speichel; S1-IgM im Bereich von 20-50 μg mL-1 und 0,6-5,0 μg mL-1 im COVID-19-Patientenserum bzw. im Speichel; und CRP im Bereich von 10-20 μg mL-1 und 0,1-0,5 μg mL-1 im COVID-19-Patientenserum bzw. im Speichel. Die Tatsache, dass alle positiven Proben im Vergleich zu negativen Proben viel höhere Signale zeigen, beweist den tatsächlichen Nutzen für die genaue Auswertung der COVID-19-Biomarker in Bioflüssigkeiten unter Verwendung unserer LEG-basierten Biosensoren. Insbesondere das beobachtete signifikante Vorhandensein von COVID-19-Biomarkern im Speichel zeigt den außergewöhnlichen Nutzen dieses Biofluids als wertvolle Quelle für die nicht-invasive Diagnose und Überwachung von SARS-CoV-2-Infektionen.

Mit dem Ziel, die Beziehung zwischen den Konzentrationen entzündlicher Biomarker, die am Zytokinsturm beteiligt sind und direkt mit dem Fortschreiten, der Schwere und dem Ergebnis der Erkrankung bei COVID-19,57, 58, 59, 60, 61, 62 assoziiert sind, zu bestätigen, untersuchten wir die Variation der Serum-CRP-Konzentrationen bei RT-PCR-negativen Probanden (n = 7) und RT-PCR-positiven COVID-19-Patienten, die klinisch nach der Schwere der Erkrankung als asymptomatisch (n = 2), mild (n = 5) und moderat (n = 2) klassifiziert wurden. Wie in Abbildung 5F dargestellt, beobachteten wir eine positive Assoziation zwischen der CRP-Konzentration und dem COVID-19-Symptom-Schweregrad, was mit den jüngsten Literaturberichten übereinstimmt.20 , 61 Künftige klinische Tests mit gepaarten Speichel- und Serumproben im Verlauf der Infektion sind erforderlich, um die Beziehung zwischen Speichel- und Serumkonzentrationen zu bestimmen und den Nutzen unserer Plattform bei der Identifizierung von schweregrad-spezifischem COVID-19 zu validieren (Tabelle 1).

Um den steigenden Bedarf an effektiven diagnostischen Werkzeugen für den einfachen COVID-19-Nachweis mit sofortiger Proben-zu-Antwort-Auswertung zu decken, haben wir die erste elektrochemische Multiplex-Plattform auf Graphenbasis, SARS-CoV-2 RapidPlex, für die sensitive, schnelle und selektive gleichzeitige Abfrage von NP-Virusantigen, S1-IgG- und S1-IgM-Isotypen und CRP in Serum- und Speichel-Biofluiden von gesunden und RT-PCR-bestätigten COVID-19-infizierten Patienten entwickelt und implementiert. Die Kombination der vorteilhaften Eigenschaften des Graphenmaterials mit der hohen Sensitivität und Spezifität der Immunosensing-Strategien macht unsere SARS-CoV-2 RapidPlex-Plattform zu einem vielversprechenden Diagnosegerät für die genaue Überwachung von COVID-19-Infektionen in Serum und nicht-invasiv zugänglichen Körperflüssigkeiten, die frei von komplexen Anforderungen an die Probenvorbehandlung sind. Aufgrund der einfachen Handhabung, der Kompatibilität mit Speichelproben und der schnellen Zeit bis zum Ergebnis hat die RapidPlex-Plattform von SARS-CoV-2 ein hohes Potenzial für die Implementierung am POC für die Patiententrilisation sowie für den Einsatz zu Hause für die telemedizinische Betreuung und Fernüberwachung.

Die Überwachung ausgewählter Targets in einem einzigen und schnellen Experiment (Target-Capture kann bis zu 1 Minute dauern) liefert substanzielle Informationen, nicht nur über die frühe COVID-19-Infektion durch Virusantigen- und IgM-Isotyp-Detektion, sondern auch über den Schweregrad der Erkrankung mittels CRP-Bewertung und die potentiell erworbene Immunität durch IgG-Isotyp-Quantifizierung. Die schnelle Vor-Ort-Evaluierung des Krankheitsschweregrads, die durch unser SARS-CoV-2 RapidPlex ermöglicht wird, bietet den unvergleichlichen Vorteil einer sofortigen COVID-19-Triage. Bei künftigen klinischen Anwendungen könnte dies nicht nur die behandelnden Ärzte auf Fälle aufmerksam machen, die eine umfassende und sorgfältige medizinische Betreuung erfordern, sondern auch die effiziente Zuweisung wertvoller medizinischer Ressourcen wie Beatmungsgeräte und Betten auf der Intensivstation im Falle eines erneuten Ausbruchs erleichtern, um die Patientenergebnisse bei einer Überlastung der lokalen Gesundheitssysteme zu optimieren.

Die von uns vorgeschlagenen Methoden, die auf einfachen, aber gut etablierten Oberflächenfunktionalisierungstechniken und Abtastprinzipien basieren, ermöglichen die einfache Übertragung auf die Erkennung anderer hochinformativer SARS-CoV-2-bezogener Reporter durch einfaches Auswechseln des Beschichtungsauffangrezeptors. Eine weitere technologische Verbesserung könnte durch die Einführung eines vollautomatischen Probenhandhabungsprozesses durch ein Mikrofluidikmodul für den telemedizinischen Einsatz erreicht werden. Eine Modifizierung unseres Plattformdesigns könnte schnelle virale Antigen- und Antikörper-Paneltests ermöglichen, so dass eine COVID-19-Infektion klar von unspezifischen Symptomen saisonaler Atemwegsinfektionen wie der Grippe unterschieden werden könnte. Darüber hinaus könnte die drahtlose telemedizinische Diagnoseplattform in Verbindung mit neuartigen tragbaren Biosensoren zur kontinuierlichen Überwachung der Vitalparameter und anderen chemischen Biomarkern umfassende Informationen über den Gesundheitszustand einer Person während der COVID-19-Pandemie liefern.63, 64, 65, 66, 67

Unsere Plattform leistet Pionierarbeit beim Multiplex-Nachweis von stadienspezifischen Biomarkern im Zusammenhang mit SARS-CoV-2, um eine detaillierte und personalisierte Momentaufnahme der COVID-19-Infektion zu liefern. Wir sind fest davon überzeugt, dass unsere entwickelte Plattform eine Testmethode mit hohem Nutzwert für die Bekämpfung dieser und künftiger Pandemien sein wird und dazu beiträgt, eine der tiefsten globalen Gesundheits-, Wirtschafts- und humanitären Krisen der modernen Geschichte zu beenden.