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PCR-basierte Methoden führen COVID-19 diagnostische Bemühungen

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Diagnostische Tests für COVID-19 haben sich seit den ersten Fällen rasch entwickelt

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Im Dezember 2019 wurden mehrere Fälle von atypischer Lungenentzündung in der Stadt Wuhan in China gemeldet. Labortests bestätigten, dass der verursachende Erreger ein neuartiges Coronavirus war, das vorläufig 2019-nCoV und jetzt SARS-CoV-2 genannt wird. SARS-CoV-2 verursacht die Krankheit, die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) offiziell als COVID-19 bezeichnet wird. Bis zum 27. Februar 2020 hat die WHO 82.294 Fälle von COVID-19 in 46 Ländern registriert. Davon wurden 78.630 in China gemeldet, die zu 2.747 Todesfällen geführt haben.

Am 30. Januar 2020 erklärte die WHO den Ausbruch von COVID-19 zu einem international besorgniserregenden öffentlichen Gesundheitsnotstand. Diese Bezeichnung macht eine zuverlässige Labordiagnose für die Interventionen im Bereich der öffentlichen Gesundheit entscheidend. "Unser Ziel ist die Früherkennung neuer Fälle und die Verhinderung der weiteren Verbreitung des Coronavirus", sagte der Direktor der US Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Robert R. Redfield, MD.

Da die weltweite Verbreitung des Virus eine COVID-19-Pandemie bedroht, kann die Früherkennung die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten unterstützen. Hier wird erörtert, wie sich diagnostische Tests für COVID-19 von den frühen Fällen bis zu den neuesten Infektionen rasch entwickelt haben.

Früherkennung eines unbekannten Virus

Anfang dieses Jahres sammelten die Forscher bronchoalveoläre Flüssigkeitsproben von den ersten Patienten und testeten sie mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf 22 Viren und Bakterien. Zuvor identifizierte Coronaviren-Stämme und andere Erreger, die bekanntermaßen Atemwegssymptome verursachen, wurden in den Proben nicht nachgewiesen. Dies war der erste Hinweis darauf, dass es sich bei dem Infektionserreger um einen neuartigen, bisher nicht identifizierten Erreger handelt.

Das Team isolierte dann Viruspartikel von denselben Patienten und untersuchte sie mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Das Virus zeigte ausgeprägte, für Coronaviren charakteristische Spitzen. Sie verwendeten die Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR), um eine konservierte Region von Betacoronaviren zu amplifizieren, was zu positiven Ergebnissen führte. Betacoronaviren waren zuvor an Ausbrüchen des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS) und des respiratorischen Syndroms des Nahen Ostens (MERS) beteiligt.

Schließlich sequenzierten die Forscher das virale Genom. Sie führten eine Sequenzanpassung und phylogenetische Analyse des neuen Virusgenoms durch, wobei sie andere Betacoronavirus-Genome (SARS-CoV und MERS-CoV) als Referenz verwendeten. In den konservierten Domänen des unbekannten Virus und anderer Mitglieder der Betacoronavirus-Familie gab es weniger als 90 Prozent Ähnlichkeit. Die Forscher kamen daher zu dem Schluss, dass die Atemwegssymptome der Patienten durch ein neuartiges Betacoronavirus verursacht wurden

Diagnostische Tests an der Spitze einer Epidemie

In den Wochen nach den ersten gemeldeten Fällen hinterlegten die Forscher für Infektionskrankheiten die SARS-CoV-2-Genomsequenzen in offenen Datenbanken wie GenBank und GISAID. Dies spornte die internationale Gemeinschaft von Wissenschaftlern und Medizinern an, eine schnelle und zuverlässige molekulare Diagnostik zu entwickeln.

Forscher am Berliner Institut für Virologie entwickelten Assays zur Unterscheidung von SARS-CoV-2-Infektionen von SARS-CoV auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Gens (RdRp). Sie validierten die Kreuzreaktivität der Assays anhand von 297 klinischen Proben, die von Patienten mit bekannten Atemwegserkrankungen stammen. Eine separate Gruppe an der Universität Hongkong entwickelte einen quantitativen Ein-Schritt-RT-PCR-Test zum Nachweis von zwei verschiedenen Regionen des genom-offenen Leserasters 1b (ORF1b) von SARS-CoV-2 und der Nukleokapsid (N)-Region. Sie validierten den Test bei zwei Patienten mit Verdacht auf COVID-19. Der N-Gen-Test war bei diesen klinischen Proben etwa 10-mal empfindlicher als der ORF1b-Test. Die von beiden Gruppen entwickelten Tests wurden mit der WHO geteilt und zur Verwendung in mehreren Ländern versandt.

In den USA entwickelte die CDC einen qualitativen Echtzeit-RT-PCR-Test zum Nachweis von SARS-ähnlichen Coronaviren und zur spezifischen Identifizierung von SARS-CoV-2. Die Primer und Sonden wurden gegen die Nukleokapsid-Region des Virus entwickelt. Zuvor mussten Proben von Personen mit Verdacht auf COVID-19 zur Untersuchung an die CDC geschickt werden. Am 4. Februar 2020 erteilte die Food and Drug Administration (FDA) jedoch eine Notfallgenehmigung des RT-PCR-Diagnostik-Panels der CDC. Nun kann der Test an die staatlichen und lokalen Gesundheitslabors der USA, an die Labors des Verteidigungsministeriums und an ausgewählte internationale Labors verschickt werden. "Die Situation entwickelt sich weiter, und die Möglichkeit, diesen diagnostischen Test an qualifizierte Labors zu verteilen, ist ein entscheidender Schritt zum Schutz der öffentlichen Gesundheit", sagte FDA-Kommissar Stephen M. Hahn, MD

Einschränkungen der vorhandenen diagnostischen Tests

Obwohl RT-PCR ein hochempfindlicher Test ist, kann er einige Nachteile haben. RT-PCR-Primer sind im Allgemeinen gegen konservierte Regionen des SARS-CoV-2-Virusgenoms gerichtet. Coronaviren haben fehleranfällige RNA-abhängige RNA-Polymerasen, so dass Mutationen und Rekombinationsereignisse häufig auftreten. Die Mutationen bei SARS-CoV-2 sind derzeit sehr begrenzt. Es muss berücksichtigt werden, wie die diagnostische Spezifität und Sensitivität von RT-PCR-basierten Assays beeinflusst werden kann, wenn sich die Mutationsrate ändert

Niedrige Viruslasten bei asymptomatischen oder leicht symptomatischen Patienten können durch RT-PCR möglicherweise nicht zuverlässig nachgewiesen werden. Positive Ergebnisse sind zwar ein Hinweis auf eine aktive SARS-CoV-2-Infektion, schließen aber eine bakterielle Infektion oder eine Koinfektion mit anderen Viren nicht aus. Sowohl positive als auch negative Ergebnisse müssen in Kombination mit klinischen Symptomen und epidemiologischen Daten interpretiert werden

Einige staatliche Gesundheitslabors sind bei der Validierung des RT-PCR-Tests der US CDC auf Probleme gestoßen. Sie berichteten über positive Ergebnisse für die negativen Kontrollen des Assays. Dies führt zu einem unschlüssigen Ergebnis, das eine zuverlässige klinische Diagnose erschwert. "...eines der Reagenzien war nicht konsistent... die Herstellung zu wiederholen ist der nächste Schritt", sagte Dr. Nancy Messonnier, Direktorin des Nationalen Zentrums für Immunisierung und Atemwegserkrankungen der CDC, in einer Telekonferenz

Derzeit werden die diagnostischen Tests an Atemwegsflüssigkeiten (Nasen-Rachen-Aspirationen, bronchoalveoläre Lavage und Sputum) und Serum durchgeführt. Eine Studie, die Primer zur Amplifikation des SARS-CoV-2-Spike (S)-Gens verwendete, konnte das Virus jedoch nicht zuverlässig in nicht-atmungsaktiven Körperflüssigkeiten wie Blut und Urin nachweisen. Die CDC arbeitet an der Entwicklung eines Bluttests, mit dem sich die gegen SARS-CoV-2 produzierten Antikörper nachweisen lassen. Dies wird zu einem besseren Verständnis der Krankheitsübertragung beitragen und helfen, eine Infektion bei Personen mit wenigen oder keinen Symptomen zu erkennen.

Kommerzielle Diagnostik in der Entwicklung

Die US-FDA hat eine Vorlage zur Überprüfung der Notfallbenutzungsgenehmigung erstellt, die auf Anfrage für Entwickler von diagnostischen Tests zur Verfügung steht. Bis heute wurde diese Vorlage mehr als 50 Entwicklern zur Verfügung gestellt, die ihr Interesse an der Entwicklung von Diagnostika für COVID-19 bekundet haben