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Pränatale Diagnose seltener Krankheiten: Der Beginn der nicht-invasiven Methoden
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Die endgültige pränatale Diagnose basiert derzeit auf invasiven Techniken, aber das kann sich ändern
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Am 28. Februar 2019 feierte die Welt den Tag der Seltenen Krankheit, um das Bewusstsein für mehr als 6.000 Krankheiten zu schärfen, von denen jeweils weniger als 200.000 US-Bürger betroffen sind. (Das ist etwa einer von 1.640 Menschen.)
Fortschritte in der molekularen Diagnostik erkennen seltenere Krankheiten zu niedrigeren Kosten als je zuvor. Für Familien mit einer Vorgeschichte von genetischen Erkrankungen oder wenn de novo-Anomalien durch Screening festgestellt werden, gibt die pränatale Diagnose den zukünftigen Eltern und Ärzten die Informationen, die sie benötigen, um die beste pränatale und postnatale Versorgung auszuwählen. Die endgültige pränatale Diagnostik beruht auf invasiven Techniken, die ein geringes Risiko einer Fehlgeburt bergen. Es entstehen jedoch nicht-invasive Techniken, die bald die traditionellen Methoden ersetzen können
Aktuelle Diagnose- und Untersuchungsmethoden
Diagnostische Tests bestätigen eine genetische Erkrankung mit einer Genauigkeit von fast 100 Prozent. Bis vor kurzem war eine definitive pränatale Diagnose nur durch invasive Methoden wie Chorionzottenentnahme (CVS) oder Amniozentese (Fruchtwasseranalyse) möglich, die bei 0,2 bzw. 0,1 Prozent der Schwangerschaften eine Fehlgeburt verursachen. Die jüngsten Fortschritte in der Molekularanalyse bieten nun ein Repertoire an Tests zum Nachweis seltener Krankheiten aus der fetalen DNA
Screening-Tests hingegen liefern einen Risikowert für Geburtsabweichungen und identifizieren Schwangerschaften mit erhöhter Wahrscheinlichkeit von (vor allem chromosomalen) Krankheiten; daher können Screening-Tests darauf hinweisen, ob genauere Diagnosetests erforderlich sind
Die Ultraschallbildgebung ist die gebräuchlichste Screening-Methode, wobei die Genauigkeit von den Fähigkeiten des Sonographen abhängt. Größere körperliche Defekte oder Aneuploidie können mit dieser Methode beurteilt werden, nicht aber monogene Erkrankungen wie Mukoviszidose
Das nicht-invasive pränatale Screening (NIPS) beinhaltet die Analyse von zellfreier fetaler DNA (cffDNA), die aus mütterlichem Blut isoliert wurde. Diese 150-180 Basenpaare (bp) Fragmente aus plazentaren Trophoblasten machen vier bis 20 Prozent der freien DNA aus. Falsch-positive und negative Ergebnisse entstehen durch niedrige cffDNA-Fraktion, Plazentmosaik, mütterliche genetische Anomalien und multiple Föten, so dass NIPS derzeit nicht für die Diagnose empfohlen wird
Molekulare Techniken zur Förderung der nicht-invasiven Erkennung seltener Krankheiten
Verbesserungen in der PCR, Microarray, Sequenzierung, Haplotypisierung und anderen molekularen Methoden kommen sowohl der Erforschung seltener Krankheiten als auch deren Nachweis durch cffDNA-basierte nicht-invasive Methoden zugute.
Wissenschaftler haben kürzlich eine gezielte Locus-Amplifikation entwickelt, um die Haplotypisierung zu vereinfachen und sie für die Diagnose von erblichen monogenen Erkrankungen bei Föten praktikabler zu machen. In anderen Bereichen zeigen chromosomale Microarray-Technologien die Pathologie der Mikrodeletion und Mikroduplikation auf; so nutzt beispielsweise der PrenaTest der deutschen Firma LifeCodexx die quantitative PCR von cffDNA, um die einzelne Mikrodeletion von Chromosom 22 zu erkennen, die zum DiGeorges-Syndrom führt. Die Deletion tritt bei einer von 3.000 Geburten auf und kann zu Lernproblemen, Herzfehlern und Immunschwäche führen.
Die Kombination von Next Generation Sequenzierung (NGS) mit fortschrittlicher Bioinformatik verbessert die Genauigkeit der cffDNA-Diagnose. So wurden beispielsweise Achondroplasie (eine Knochenstörung, die einen unverhältnismäßigen Zwergwuchs verursacht) und thanatophorische Dysplasie (eine schwere Skelettstörung) mit einer Genauigkeit von 96,2 Prozent mittels NGS bestätigt
Neue PCR-Methoden führen auch zu einer verbesserten nicht-invasiven pränatalen Diagnostik. Der Fluidigm Mikrochip, eine empfindliche digitale PCR-Methode, die einzelne Fragmente verstärken kann, kann Hämophilie und Sichelzellenanämie aus cffDNA diagnostizieren. LifeCodexx berichtete von einer höheren Genauigkeit, Wirtschaftlichkeit und Geschwindigkeit für ein NIPS mit Echtzeit-PCR im Vergleich zu NGS oder Microarray
Andere Forschungsgruppen konzentrieren sich darauf, die cffDNA-Ausbeute aus mütterlichen Blutproben zu erhöhen und damit die Zuverlässigkeit von NIDS zu verbessern. Als die cffDNA-Fraktion mit Agarose-Gel-Größenselektion angereichert wurde, fanden die Forscher den positiven prädiktiven Wert, der die Zuverlässigkeit eines diagnostischen Tests anzeigt, der im Vergleich zu Standard-NIDS um sechs Prozent verbessert wurde. Andere Strategien beinhalten die Verbesserung der Stabilität der fetalen Fraktion in Blutabnahmeschläuchen, um die für die Analyse verfügbare cffDNA zu maximieren
Jüngste Forschungen haben weitere Merkmale aufgedeckt, die die NIPS-Spezifität weiter erhöhen können, wie z.B. die Hypomethylierung von cffDNA-Fragmenten. Allerdings können nicht alle Mutationen und Anomalien mit NIPS nachgewiesen werden; so wird beispielsweise das Fragile-X-Syndrom, das die kognitiven Fähigkeiten beeinträchtigt, durch 1.000 bp Wiederholungen verursacht, die nicht in den kurzen cffDNA-Fragmenten enthalten sind.
Fetale zellbasierte Diagnose
Das Vorhandensein intakter fetaler Zellen im mütterlichen Blut wurde in den späten 1960er Jahren entdeckt. Seitdem wird versucht, diese Zellen für die Diagnose zu nutzen, da sie ganze fetale Genome liefern, die von der mütterlichen DNA getrennt sind, und nicht Fragmente. Leider sind diese Zellen, von denen die meisten nukleierte rote Blutkörperchen (nRBCs), Trophoblasten und Leukozyten sind, bei etwa einer Zelle pro Milliliter Blut unglaublich knapp. Diese Seltenheit und der Mangel an fetalspezifischen Zellmarkern haben die Technologie verzögert. Die folgende Liste enthält nur einige der Forschungsarbeiten, die im Hinblick auf die Entwicklung praktikabler nicht-invasiver diagnostischer Tests für fetale Zellen durchgeführt werden:
Eine kürzlich entwickelte, auf fetalen Zellen basierende Diagnosemethode verwendet eine Kombination aus RBC-Lyse, magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS), fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und manueller Trennung von fetalen Zellen. MACS und FACS setzen auf monoklonale Antikörper gegen Zelloberflächenmarker, aber die Kontamination ist ein Problem, da sich fetale und mütterliche Zellen Marker teilen. Daher beinhaltet diese Methode eine manuelle Zellauswahl zur Trennung von fetalen und mütterlichen Zellen als letzten Schritt; die manuelle Zellauswahl kann jedoch für das durchschnittliche diagnostische Labor zu arbeitsintensiv sein.
Um das Problem der unspezifischen Antikörperabscheidung zu überwinden, wurde eine Technik entwickelt, die die Zentrifugation des Dichtegradienten verwendet, um mit der Zellseparation zu beginnen, gefolgt von der lektinbasierten Erythroblastenisolation, der chemischen Färbung von Blutzellen und der automatisierten Bilderfassung und Laserabscheidung Mikrodissektion (LCM). Diese Technik wurde erfolgreich zur Isolierung von nRBCs eingesetzt
Die Gründer von Fetolumina Technologies Corp. hoffen, dass ihre nanoVelcro-Mikrochips zur Anreicherung fetaler Trophoblasten aus mütterlichem Blut zu einer zuverlässigen nicht-invasiven Diagnose führen werden. Die Chips sind mit Antikörpern bedruckt, um Trophoblasten einzufangen. Die immunzytochemische Markierung unterscheidet Trophoblasten von mütterlichen weißen Blutkörperchen für LCM. Nicht nur ausreichende Zellen wurden mit diesen Chips gefangen genommen, sondern auch die Technik der array comparative genomic hybridization (aCGH) diagnostizierte Trisomie 13, 18 und X sowie eine seltene chromosomale Deletion und Duplikation.
Wissenschaftler entwickeln Cell Reveal™ - einen mikrofluidischen Chip, der mit Zellmarker-Antikörpern für nRBCs und Trophoblasten beschichtet ist. Das System beinhaltet ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einem automatisierten Bildanalysator ausgestattet ist, der Zellen selektiert. Die vollständige Automatisierung der Technik macht sie für die Diagnose besser geeignet, sofern sie kostengünstig ist. Da Cell Reveal™ sowohl nRBCs als auch von der Plazenta abgeleitete Trophoblasten einfängt, können False-Positive durch Plazentmosaik bestätigt werden, was jedoch noch nicht bewiesen ist.
Die Gründerin von Rarecells Diagnostics, Patrizia Paterlini-Bréchot, gab im vergangenen Jahr bekannt, dass das Unternehmen einen vollautomatischen, auf fetalen Zellen basierenden Test entwickelt hat, der Zellen nach Größe und nicht nach Antikörpern isoliert und so den Einfang mütterlicher Zellen verhindert. Das Produkt, ISET genannt, soll durchschnittlich 25-35 fetale Trophoblasten aus 10 Millilitern Blut sammeln
Wissenschaftler haben kürzlich eine kapillarbasierte Zellselektion entwickelt, um fetale Trophoblasten zu trennen, die mit Antikörpern gegen Zelloberflächenmarker angereichert und gefärbt sind. Unter Verwendung der gesamten Genomsequenzierung und aCGH identifiziert der Test präzise Aneuploidie, Translokationen, Deletionen und Duplikationen. Arcedi Biotech führte das Produkt im Mai 2018 in der dänischen Zentralregion ein und strebt eine hochvolumige und vollautomatische Version an.
Schlussfolgerungen
Seltene Krankheiten als Ganzes betreffen 25-30 Millionen Menschen in den USA. Rund 80 Prozent der seltenen Krankheiten haben einen genetischen Ursprung, und die Prädisposition für eine Erkrankung bedeutet, dass Familienmitglieder oft Lust auf eine pränatale Diagnose haben. Die Diagnose hilft Ärzten und Eltern, die Behandlung und Pflege zu planen, und in einer Handvoll von Fällen ist eine Behandlung in der Gebärmutter möglich. Manchmal sind die Aussichten auf Lebensqualität jedoch so schlecht, dass die Kündigung die bessere Option ist. In allen Fällen ist eine frühzeitige und genaue Diagnose der Schlüssel zum bestmöglichen Ergebnis
Die Umsetzung der Diagnose seltener Krankheiten wird von staatlichen Initiativen sowie von Biotech-Unternehmen und klinischen Labors abhängen, die die Gesundheit der Menschen vor den wirtschaftlichen Nutzen stellen. Ständig weiterentwickelte NIPS-Methoden, das Aufkommen von Tests auf der Basis von Fötuszellen und neue Methoden zum Nachweis seltener genetischer Anomalien bedeuten, dass werdende Eltern weltweit bald von einer genauen nicht-invasiven pränatalen Diagnose profitieren könnten.