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Reinigungs-Antikörper unter Verwendung Ion Exchange Chromatographys

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Ionenaustauschchromatographie (Iec) ist eine chromatographische Methode, die angewendet wird, um biologische Mittel zu trennen. Die Basis der Trennung in Iec ist umschaltbare Aufnahme (Oberflächenabsorption) von belasteten Molekülen auf eine stationäre Phase.

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Die stationäre Phase wird von stillgestellten Ionenaustauschgruppen gemacht, die die gegenüberliegende Gebühr als die Zielkomponente haben, die in der Mobilen Phase getragen werden soll. Im Allgemeinen werden Ionenaustauschexperimente in fünf Stadien durchgeführt.

Was ist Iec und wie wird es durchgeführt?

Die erste Phase von Iec wird Gleichgewichtherstellung genannt. Während dieses Prozesses wird die stationäre Ionenaustauschphase abgeglichen, um zu garantieren, dass sie an den optimierter pH- und Ionenstärkezuständen funktioniert, um Aufnahme der polaren Komponente des Ziels der stationären Phase zu maximieren.

Die Austauschoberfläche ist ein Harz, das eine Matrix von belasteten ionisierbaren Funktionsgruppen oder von Ligands enthält. Diese stationäre Phase zeigt diese Funktionsgruppen an, die Ioneninteraktionen mit dem Analytion der gegenüberliegenden Gebühr bilden. Es ist wichtig, electroneutrality instandzuhalten, das der Zustand ist, in dem die Nettogebühr des Systems null ist. Counterions sind in der Gleichgewichtherstellungslösung anwesend.

In der zweiten Etappe muss das polare Analytgeschenk des Ziels in der beweglichen Beispielphase mit counterions für Aufnahme zur Mobilen Phase konkurrieren. Dieses Prozessergebnisse in counterion Verschiebung; irgendwelche Komponenten, die nicht imstande sind, Durchlauf durch die Spalte zu binden und sofort eluiert werden.

In der dritten Phase tritt die Desorption der verklemmten Analyten auf. Dieses wird erzielt, indem man die verbindlichen Bedingungen, hauptsächlich ändert, indem man den pH ändert oder die Ionenstärke des Eluierungspuffers erhöht.

In der letzten Methode wird ein Eluierungspuffer der zunehmenden Salzkonzentration an der Spalte angewendet und Analyten werden vom Harz in der Reihenfolge der zunehmenden verbindlichen Stärke freigegeben. Dieses tritt auf, weil die counterion Konzentration mit den verklemmten Analyten sich erhöht und konkurriert. Die schlecht verbindlichen Analyten werden zuerst freigegeben, während jene Analyten, die zum starken Ionenabbinden fähig sind, eluiertes letztes sind.

Das Vierter-Stock wird Ende der Desorption kategorisiert, und im fünften und im Endstadium, wird die Spalte erneuert. Regeneration stellt die Spalte zurück, also kann sie für eine andere Reinigung verwendet werden. Trennung von polaren Analyten innerhalb einer komplexen Mischung ist möglich, weil ihre Unterschiede bezüglich der Nettogebühr, der Ladungsdichte und der Ladungsverteilung differenziale Interaktion mit der stationären Ionenaustauschoberfläche zulässt. Die Dynamik ihrer Interaktion mit der Ionenaustauschoberfläche kann manipuliert werden, indem man die Ionenstärke und den pH der Mobilen Phase während der Eluierung sich unterscheidet.

Die Gebühreneigenschaften von biologischen Molekülen sind bemerkenswert; Ionenaustauschchromatographie ist günstig, wenn man Proteine trennt, wie sie hochauflösende Trennung zwischen Proteinen liefert, die nur durch eine einzelne Aminosäure sich unterscheiden.

Iec-ansässige Antikörpertrennung

Es gibt einige chromatographische Prozesse, die die Isolierung von Antikörpern erleichtern, indem sie verschiedene biochemische Eigenschaften nutzen. Die Trennung, die auf Größe basieren, das hydrophobicity, die Löslichkeit und die Schwergängigkeitsaffinität sind Beispiele, die verwendet worden sind. Wichtig machen die verschiedenen Gebühreneigenschaften von Antikörpern sie zugänglich Reinigung durch Iec;

Antikörper sind proteinartige biologische Moleküle, und ihre Gebührenproteine können unter Verwendung Iecs manipuliert werden. Die Nettogebühr der Moleküle des Interesses bestimmt die Art von Iec, die benutzt werden kann. Wenn positiv - belastete Mittel sind das bis zum der Mobilen Phase gefangen genommen zu werden Ziel, ein Kationenaustauschharz wird gewählt. Andererseits positiv - lud Anionenaustauschharz wird vorgewählt als negativ auf - belastete Moleküle sollen stillgestellt werden.

Die allgemeinsten Harze, die in den Antikörperreinigungsprotokollen benutzt werden, sind Agaroseperlen des Proteins A. Es gibt eine Vielzahl anderer handelsüblicher Harze, die möglicherweise benutzt werden, jedoch. Die Bindefähigkeit des Harzes, zusammen mit der Länge der Spalte, bestimmt die Anzahl von Zyklen von Iec, die aufgenommen werden müssen, um die Antikörper zu verarbeiten, die vom schwimmenden von den Zellen erbracht werden, die ausgeführt werden, um hohe Quantitäten des gewünschten Antikörpers auszudrücken.

Kationenaustauschharze sind berichtet worden, um hohe Erträge zu produzieren und die Quantität des Wirtszelleproteins (HCP) zu verringern; HCPs sind Prozess-bedingte Verunreinigungen, die von der Wirtszelle vom Ausdruck von recombinant, biotherapeutic Proteinen abgeleitet werden, wie Antikörpern. Zusätzlich ist der Prozess in hohem Grade selektiv, solche diese Schwergängigkeit ist spezifisch zur konstanten Region von Antikörpern.

Antikörper werden als therapeutische Mittel in der Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Arthritis und Krebs in zunehmendem Maße überwiegend. Infolgedessen erhöht sich der Marktwert von Antikörpern. Monoklonale Antikörper (MAb) werden durch Säugetier- Zellen produziert und die gleiche Struktur besitzen. Die Reinheit dieser klonischen Bevölkerungen ist für klinische Wirksamkeit wesentlich.

MAb-Titer sind gewöhnlich so hoch wie 5 bis 10 g/l, aber ihre abwärts gerichtete Reinigung schafft einen Engpass in ihrer Endproduktion. Iec liefert eine Methode, durch die Antikörper mit hohem Ertrag und Selektivität gereinigt werden können.