{{{sourceTextContent.title}}}

Ein neues Verfahren zur Abbildung dicker Proben

{{{sourceTextContent.subTitle}}}

Beseitigung von Bildunschärfen ohne Konfokalisierung

{{{sourceTextContent.description}}}

Geförderter Inhalt: Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskope (WF) bieten eine hochauflösende Bildgebung für dünne Proben, sind aber aufgrund der Hintergrundfluoreszenz, die zu Bildunschärfen führt, nur begrenzt in der Lage, dickere Proben abzubilden. Optische Schnitte sind eine effektive Lösung für dieses Problem, erforderten aber bisher ein konfokales System oder eine Entschärfungssoftware. Mit der optischen Schnitttechnik, die jetzt in Diascannern zum Einsatz kommt, können Forscher von den konfokalen Möglichkeiten zur Abbildung dickerer Proben profitieren - und das bei deutlich höherem Durchsatz.

Grenzen der Weitfeldmikroskopie

Die WF-Mikroskopie ist eine allgegenwärtige Bildgebungstechnik, die bei dünnen Proben (<10 µm) sehr effektiv ist. Bei der WF-Mikroskopie wird von der Kamera sowohl Licht aus der fokussierten als auch aus der unscharfen Ebene erfasst, was bei dünnen Proben kein Problem darstellt. Bei der Abbildung dickerer Proben führt diese unvermeidliche Hintergrundfluoreszenz zu Bildunschärfe und schlechtem Kontrast und verdeckt die interessierenden Strukturen. Die konfokale Mikroskopie und andere Rasterbeleuchtungstechniken können dieses Problem lösen. Bei diesen Verfahren wird die Beleuchtung in ein festes Muster geformt, was zu einem optisch geschnittenen Bild führt. Diese Systeme können unter günstigen Bedingungen hervorragende Bilder erzeugen. Sie sind jedoch mit erheblichen Kosten verbunden und setzen voraus, dass gut definierte und kontrollierte Beleuchtungsmuster in die Probe eingebracht werden.

Ein neuer Beleuchtungsansatz

Um die Auswirkungen der Hintergrundfluoreszenz auf den Bildkontrast und die Bildqualität zu vermeiden, sind nicht immer genau definierte und kontrollierte Beleuchtungsmuster erforderlich. Eine Technik, die als HILO-Mikroskopie bekannt ist, verwendet zufällige Speckle-Muster, um die fluoreszierende Probe zu beleuchten. Speckle-Muster weisen eine körnige Intensität mit inhärent hohem Kontrast auf, so dass die mit Speckle-Beleuchtung erhaltenen Fluoreszenzbilder körnig erscheinen. Diese Körnigkeit bietet Kontrast und einen direkten Hinweis darauf, wie scharf die Probe ist.

Bei der HILO-Bildgebung werden zwei Rohbilder erfasst und verarbeitet. Das erste ist ein reguläres WF-Bild mit gleichmäßiger Beleuchtung. Auf dieses Bild wird ein Hochpassfilter angewendet, um die Hochfrequenzinformationen zu extrahieren - der "HI"-Teil der HILO-Mikroskopie. In diesem Schritt werden niederfrequente Informationen eliminiert, einschließlich der Informationen innerhalb und außerhalb des Schärfebereichs. Das zweite Bild wird mit Speckle-Beleuchtung aufgenommen, um die niederfrequenten, unscharfen Bildinformationen wiederherzustellen - der "LO"-Teil der HILO-Mikroskopie. Diese Bilder werden mit einem Algorithmus verarbeitet, der die Informationen über die Schärfe extrahiert und die Hintergrundfluoreszenz eliminiert. Die beiden Bilder werden dann miteinander verschmolzen (Abb. 1), um ein Bild zu erhalten, das Informationen aus dem gesamten Frequenzbereich enthält, wobei das unscharfe Licht entfernt wird.

Das optische SILA-Schneidegerät ist eine Bildgebungslösung mit hohem Durchsatz für Slideview VS200-Forschungsobjektträger-Scanner, die auf der HILO-Mikroskopie basieren. Es handelt sich um eine Zusatztechnologie für Widefield-Mikroskope (WF), die unscharfes Licht eliminiert und scharfe optische Schnitte erzeugt, die der Konfokalmikroskopie entsprechen. Das SILA-Gerät kann leicht zu jedem VS200-System hinzugefügt werden und bringt Vorteile für eine breite Palette von Anwendungen, die eine hochwertige optische Abbildung dickerer Proben erfordern.

Einstellbares optisches Schnittbild

Da das SILA-Gerät das herkömmliche WF-Bild und das Speckle-Bild mathematisch verarbeitet, ist es möglich, den Grad des optischen Schnitts mit einem einzigen Parameter einzustellen, den wir Schnittstärke (ST) nennen. Wenn die ST hoch eingestellt ist, zeigen die Bilder Informationen aus einer größeren Schärfentiefe, was den Eindruck eines WF-Bildes vermittelt.

Abbildung 2 zeigt einen Gehirnschnitt, der mit ST5 aufgenommen wurde. Bei diesem hohen ST-Wert bleiben viele unscharfe Bereiche übrig. Wenn der ST-Wert sinkt, zeigt das Bild Informationen aus einer geringeren Schärfentiefe. Bei der Betrachtung des Hirnschnitts, der bei ST2 und ST1 aufgenommen wurde, bleiben daher die unscharfen Informationen erhalten, während die unscharfen Elemente verschwunden sind. Die Möglichkeit, den optischen Schnitt auf diese Weise zu optimieren, ermöglicht die Visualisierung in verschiedenen Tiefen und entfernt gleichzeitig die Hintergrundfluoreszenz. Diese Funktion des SILA-Geräts für den VS200-Scanner ist mit konfokalen Mikroskopsystemen vergleichbar, bei denen durch Änderung der Lochblendengröße ein ähnlicher Effekt erzielt werden kann.

Entfaltungsmöglichkeiten

Vor der Entwicklung des SILA-Geräts verfügten die VS200-Scanner über eine alternative Lösung zur Entfernung von unscharfem Licht aus WF-Bildern. Mit der Trusight-Entfaltungssoftware ist es möglich, Bilder mit 2D-Constrained-Iterative-Algorithmen (CI) zu entfalten. Mit diesem softwarebasierten Ansatz lässt sich ein Teil des unscharfen Lichts gut entfernen. Sie entfernt jedoch nicht so viel unscharfes Licht und bietet auch nicht die optische Schnittoptimierung wie die im SILA-Modul verwendete kombinierte Software und Hardware. Die Dekonvolution stellt jedoch eine praktikable Zwischenlösung für die Betrachtung dünnerer Proben dar, bei denen ein optischer SILA-Schnitt nicht möglich ist. Die Unterschiede in der Bildqualität zwischen konventionellen WF-, Software-dekonvolvierten und SILA-Bildern sind in Abbildung 3 dargestellt.

Anwendungen der SILA-Bildgebung

Die optische SILA-Schneidetechnologie kann für viele Forschungsanwendungen von großem Nutzen sein, insbesondere bei der Abbildung von fixierten, dicken Zellschichten und Gewebeproben. Mit Optimierungsfunktionen für den Schnitt sowie einer vergleichbaren Unschärfeunterdrückung und einem vergleichbaren Bildkontrast wie bei konfokalen Mikroskopen liefert SILA qualitativ hochwertige Bilder mit einem erheblich verbesserten Durchsatz.

Die Möglichkeit, dickere Proben abzubilden, ist in der neurowissenschaftlichen Bildgebung von Vorteil, da hier oft dicke Gewebeschnitte erforderlich sind, um die Morphologie des Präparats zu erhalten. Die Abbildung von Hirnschnitten ist bekanntermaßen eine Herausforderung. Sie ist besonders schwierig, weil Hirngewebe dazu neigt, Licht zu streuen. Traditionell werden konfokale oder Zwei-Photonen-Mikroskopiesysteme benötigt, um ein qualitativ hochwertiges, kontrastreiches Bild zu erhalten, aber diese Systeme benötigen sehr viel Zeit, um einen großen Bereich wie einen Hirnschnitt abzubilden. Durch das automatische Scannen des Objektträgers, das das VS200-System mit dem SILA-Gerät ermöglicht, können dicke Proben in einem Bruchteil der Zeit in hoher Qualität abgebildet werden (Abbildung 4).

Die Organoidforschung ist ein weiterer Bereich, der von der SILA-Bildgebung profitiert, da die Bildgebung von Organoiden ähnliche Herausforderungen wie die Neurowissenschaften stellt. Die Abbildung von Organoiden ist aufgrund der dicken Proben schwierig, und es müssen große Bereiche abgebildet werden, damit die Morphologie der Organoide richtig untersucht werden kann. Als Ganz-Objektträger-Scanner kann das VS200-System mit dem SILA-Modul die für die Abbildung dieser großen Proben erforderliche Abdeckung bieten. Die automatische Bildverarbeitung, die probenunabhängige Punktspreizfunktion (PSF) und der einfache Arbeitsablauf ermöglichen eine schnelle Bildaufnahme. Das SILA-Gerät ist auch für die Krebsforschung, die räumliche Biologie, die Botanik, die Embryologie und viele andere Bereiche von Nutzen, in denen eine hochwertige Bildgebung von dicken Proben über große Flächen erforderlich ist.

Zusammenfassung

SILA-Imaging kann den optischen Schnitt optimieren, die Unschärfe der Proben reduzieren und den Bildkontrast vergleichbar mit hochentwickelten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen verbessern. Der VS200 Slide Scanner mit dem SILA-Gerät bietet im Vergleich zu konfokalen Systemen einen deutlich höheren Durchsatz und ermöglicht eine schnelle Bildgebung großer und traditionell schwer abzubildender Proben, was für die Neurowissenschaften, die organoide Forschung und andere Bereiche von großem Nutzen ist.