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Der Wundheilungstest, auch als Scratch-Assay bekannt, ist eine etablierte zweidimensionale (2D) Technik, mit der kollektive Migration und Wundheilung in vitro untersucht werden können [1], [2]. Diese Methode war eine der ersten, die für die Untersuchung der Zellmigration entwickelt wurde, und misst die Geschwindigkeit, mit der Zellen in einem Zell-Monolayer wandern, um eine zellfreie Lücke zu füllen [1], [3]. Dreidimensionale (3D) Wundheilungstests sprengen den Rahmen dieses Artikels und wurden von Stamm et al. 2016 [2] prägnant behandelt.

Der Wundheilungstest ist eine einfache und kostengünstige Methode. Obwohl dieser Assay nicht die genauen Bedingungen einer Wunde rekapituliert, kann er erfolgreich zur Modellierung und Untersuchung der Zellbewegung in einer kontrollierten In-vitro-Umgebung eingesetzt werden. Die Technik reproduziert die Wundheilung, indem sie eine Lücke in einer konfluierenden Zellmonolage erzeugt, und besteht aus vier Hauptschritten, die im Folgenden näher erläutert werden (siehe Abbildung 1 für einen Überblick)[1].

Der erste Schritt des Assays besteht in der Kultivierung eines konfluenten Zell-Monolayers. Dieser Monolayer stellt die in vivo-Bedingungen des Gewebes vor der Wunde dar, wie z.B. ein intaktes Epithel. Meistens werden Epithel- und Endothelzellen zur Herstellung des Monolayers verwendet, insbesondere Zelltypen, die zur Schichtmigration fähig sind [4]. Studien haben auch die Migration von vaskulären glatten Muskelzellen untersucht [5], [6].

Je nach dem im Assay verwendeten Zelltyp kann die Zellproliferation ein Störfaktor sein. Die Zellproliferation kann mit der Zellmigration konkurrieren, um die während des Assays entstandene Lücke zu füllen. Wenn dies der Fall ist, kann das Zellmedium optimiert werden, um die Zellproliferation zu reduzieren. Die Verringerung der Serumkonzentration (Serumverhungern) ist die häufigste Veränderung. Proliferationsinhibitoren, wie Mitomycin C, können dem Medium ebenfalls zugesetzt werden. Eine sorgfältige Optimierung ist erforderlich, da jede Veränderung des Mediums zu unvorhersehbaren zeit- und zelltypabhängigen Effekten führen kann, die den Assay stören können [1].

Nachdem die Zellen konfluent geworden sind, besteht der nächste Schritt darin, einen zellfreien Spalt im Monolayer herzustellen. Die am häufigsten verwendete Methode ist das Aufwickeln des Monolayers durch mechanisches Kratzen (Kratzwunde) oder Stempeln. Alternativen zur mechanischen Beschädigung können thermische, elektrische und optische Wunden sein [2], [7]. In mikrofluidischen Wundheilungstests wurden chemische und enzymatische Behandlungen eingesetzt, um Zellen aus Flüssigkeitskanälen zu entfernen [5], [6], [8], [9]. Es wurden auch Methoden beschrieben, die Zellschäden gänzlich vermeiden, wie z.B. der physikalische Ausschluss [4], [10].

Die Vorbereitung von Lücken kann manuell oder automatisiert erfolgen. Zu den Nachteilen der manuellen Methode der Wundversorgung gehören der geringe Durchsatz und die Variation der Spaltbreite von gut zu gut [1], [11]. Diese Reproduzierbarkeit kann durch den Einsatz kommerzieller Werkzeuge zur Herstellung gleichmäßiger Spaltbreiten verbessert werden [1]. Modifikationen des Wundheilungstests, die eine Automatisierung nutzen, können sowohl den Durchsatz erhöhen als auch die Reproduzierbarkeit verbessern [2], [7]. Die Sicherstellung der Reproduzierbarkeit ist wichtig für den folgenden Datenerfassungsschritt.

Wenn ein zellfreier Spalt präpariert ist, können mit Hilfe der Lichtmikroskopie Zellen beobachtet werden, die in das Wundgebiet einwandern. Die Zellmigration lässt sich am besten mit Phasenkontrast- statt mit Fluoreszenz-Bildgebung beobachten, und die Wundfläche im Sichtfeld sollte mit dem Objektiv maximiert werden [12] [13].

Sobald das Mikroskop eingerichtet ist, kann eine Reihe von Zeitrafferaufnahmen (Momentaufnahme-Methode) aufgenommen werden, während die Zellen in den zellfreien Spalt einwandern [1]. Diese Zeitpunkte sollten innerhalb von 24 Stunden nach Beginn des Experiments gesammelt werden, um die verwirrenden Auswirkungen der Zellreplikation auf die Lückenschließung zu minimieren. Die Migrationsbilder können dann zum Sammeln von Messungen verwendet oder visuell ausgewertet werden [4]. Genaue Messungen können manuell mit einer am Mikroskop angebrachten Digitalkamera erfasst werden; dieser Vorgang ist jedoch zeitaufwändig, und die Aufrechterhaltung desselben Sichtfeldes entlang jeder Lücke kann schwierig sein [4].

Die Nachteile, die bei der manuellen Aufnahme auftreten, lassen sich weitgehend durch eine Automatisierung überwinden, die die Aufnahme von lebenden Zellen ermöglicht. Zu den Aspekten der Akquisition, die automatisiert werden können, gehören: Bildaufnahme, Punktbesuche und Umgebungskontrolle [2], [4]. Die Automatisierung hat auch eine größere Funktionalität, z.B. kann sie zur Bestimmung der experimentellen Endpunkte und zur Erzeugung kinetischer, funktioneller und quantitativer Messungen lebender Zellen verwendet werden (siehe Abbildung 2) [1].

Für den Wundheilungstest können bildgebende Systeme für die Ganzkörperuntersuchung eingesetzt werden. Für Forscher, die an einer solchen Funktionalität interessiert sind, siehe die CytomSMART Omni Landing Page. Dieses bildgebende System für lebende Zellen arbeitet in Zellkultur-Inkubatoren und ist voll automatisiert, um auf einfache Weise Zeitraffervideos von Lückenverschlüssen zu erstellen.

Sobald Bilder von der Lückenschließung aufgenommen wurden, können verschiedene Analysemethoden zur Quantifizierung der Zellmigrationsrate verwendet werden. Die erste Methode misst die Veränderung der Wundbreite (Nanometer) über die Zeit. Diese Breite ist der durchschnittliche Abstand zwischen den beiden Rändern des Kratzers. Mit der zweiten Methode wird die Veränderung der Wundfläche im Laufe der Zeit als Prozentsatz des Wundverschlusses berechnet. Diese beiden Methoden können zeitaufwendig sein, wenn sie manuell durchgeführt werden. Die letzte Methode misst die relative Wunddichte über die Zeit als Prozentsatz und wird am häufigsten in Software für Live-Cell-Bildgebung angewendet [1], [12]. Bei dieser Methode wird das Verhältnis der belegten Fläche in der Lücke zur Gesamtfläche der Anfangslücke berechnet. Die Methode der relativen Wunddichte kann weiter verfeinert werden, um die Zellproliferation oder pharmakologische Effekte zu berücksichtigen. Dies kann durch die Zählung von Zellen in Subregionen innerhalb und außerhalb der Wundfläche zur Bestimmung der relativen Zelldichte erreicht werden [12]. Die Gesamtzellzahl innerhalb des Wundgebietes kann auch zur Beurteilung der Zellmigration und Wundheilung verwendet werden [2].

Die meisten Wundheilungsuntersuchungen verwenden zum Teil immer noch manuelle Datenerfassung und -analyse. Die manuelle Extraktion von Daten ist sehr zeitaufwendig, subjektiv und fehleranfällig. Daher bleibt die Analyse großer Datensätze bei vielen Assays ein Flaschenhals. Darüber hinaus erschwert die Vielzahl der verfügbaren Assays den Vergleich zwischen den Experimenten [2]. Es wurde eine automatisierte Datenanalysesoftware wie TScratch und ImageJ entwickelt, die die Analyse erheblich beschleunigen und die mit der Bildqualität verbundenen Einschränkungen überwinden kann [14], [15].

Der Wundheilungstest wird zur Untersuchung der Zellmigration und Wundheilung eingesetzt. Unter Zellmigration versteht man die Bewegung von Einzelzellen, Zellblättern und Clustern von einem Ort zum anderen, wobei zwei Haupttypen identifiziert wurden, nämlich die Einzelzellmigration und die kollektive Zellmigration. Letztere wird von Grada et al. (2016) definiert als die koordinierte Bewegung einer Gruppe von Zellen, die ihre interzellulären Verbindungen und kollektive Polarität aufrechterhält [1].

Die kollektive Migration kann je nach extrazellulärer Matrix zwei verschiedene Formen annehmen. Die dreidimensionale kollektive Migration findet auf einem Gewebegerüst statt, und es handelt sich dabei um die Bewegung von Zellen, die in einem multizellulären Netzwerk von Strängen organisiert sind. Die zweidimensionale (2D) kollektive Migration (Blattmigration) findet über eine Gewebeoberfläche statt, und es ist die Bewegung von flachen Monolayer-Blättern. Die Wundheilung ist ein Beispiel für Blattmigration [1].

Während der Wundheilung treten vier Prozesse auf, nämlich Blutstillung, Entzündung, Migrationsproliferation und Reife-Umbau [1], [2]. Nach einer Verletzung und unter dem Einfluss von Wachstumsfaktoren und Zytokinen beginnen Keratinozyten am hinteren Wundrand zu proliferieren und auf den Wundgrund zu wandern. Dieser Prozess beinhaltet Zellmigration, -proliferation und -differenzierung [1].

Der Wundheilungstest ist eine bequeme und wirtschaftliche Methode zur Untersuchung der kollektiven Zellmigration unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Da die kollektive Zellmigration mit vielen physiologischen und pathologischen Prozessen im Zusammenhang mit der Embryogenese, Wundheilung und Krebsmetastasierung verbunden ist, ist der Wundheilungstest breit anwendbar [4], [8]. Der Assay kann verwendet werden, um die Auswirkungen der Zell-Matrix und der Zell-Zell-Interaktion auf die Zellmigration zu untersuchen, und er kann mit der Transfektion kombiniert werden, um den Einfluss der Expression exogener Gene auf die Migration einzelner Zellen zu bestimmen [1], [3].

Ein mikrofluidischer Wundheilungstest wurde von Wei et al. (2015) entwickelt, um die Migration von Zellen der vaskulären glatten Muskulatur zu untersuchen. Die Migration dieser Zellen nach einer Endothelverletzung ist ein inhärenter Faktor für das Fortschreiten der Atherosklerose und die mit der Intimahyperplasie verbundenen Komplikationen [6]. Beide Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität [17]. Das Verständnis der Prozesse, die an dieser Migration beteiligt sind, kann potenzielle Ziele für eine Hemmung liefern. Dieser modifizierte Wundheilungstest ist eine genauere Darstellung der im Gefässsystem vorhandenen Mikroumgebung. In der Studie wurde ein mikrofluidischer Wundheilungstest unter Verwendung von fünf Typen von VSMCs durchgeführt [6].

Der Wundheilungstest kann bei der Untersuchung von Wundverbänden eingesetzt werden. Alves et al. (2020) verwendeten den Assay, um neuartige Hydrogel-Mischungen als potenziellen Wundverband zu untersuchen. Die Wirkung des Hydrogels auf den Wundverschluss wurde durch Einbringen des Hydrogels in das Zellmedium beurteilt. Die Autoren zeigten, dass Hydrogele zur Verbesserung des Wundheilungsprozesses eingesetzt werden können, indem sie die Migration, Adhäsion und Proliferation von Fibroblasten fördern [18].

Inhibitoren der Zellinvasion und Metastasierung können mit Hilfe des Wundheilungstests effektiv untersucht werden. Wang et al. untersuchten erfolgreich zytotoxische Alkaloide auf ihre Fähigkeit, biologische Prozesse im Zusammenhang mit Zellmigration und Zytoskelettdynamik zu hemmen. Die Studie konnte bestimmte zytotoxische Alkaloide als Anti-Migrations-Agenzien identifizieren, die weiter untersucht werden konnten [19].

Ich habe einen biowissenschaftlichen Hintergrund mit einem Doktortitel in Molekular- und Zellbiologie. Meine Doktorarbeit befasste sich mit einem Tiervirus, um seine Genetik zu verstehen und einen Impfstoffkandidaten zu entwickeln. Meine Arbeit konzentrierte sich auf die Entwicklung von Subunit-Impfstoffen, um Viren zu stoppen, die unsere Gesundheit beeinträchtigen und sich auf unsere Wirtschaft auswirken. Dazu gehören HIV, das humane Papillomavirus (das Gebärmutterhalskrebs verursacht) und Viren, die Schafe und Schweine infizieren.

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